異常形態(tài)精子對(duì)植入前胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響

劉闖，馬媛，劉忠尖，曹澤磊，李博，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

精子形態(tài)學(xué)是反映男性生育能力的一個(gè)重要指標(biāo)，已有研究證實(shí)精子畸形率與不同的生育力評(píng)價(jià)的終點(diǎn)指標(biāo)存在相關(guān)性。正常的精子活力和濃度是卵母細(xì)胞常規(guī)體外受精(IVF)必不可少的條件之一，然而，精子形態(tài)異常導(dǎo)致較低的受精潛能，尤其是頭部形狀更為重要[1]。WHO《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)指出正常形態(tài)精子占比的參考值下限為4%[1]，與第四版中參考值下限15%相比，異常形態(tài)精子癥的范圍大大縮小。那么，在輔助生殖技術(shù)(ART)助孕過(guò)程中，異常形態(tài)精子(畸形率≥98%)對(duì)植入前胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局是否存在影響，以及如何選擇受精方式(IVF/ICSI)目前尚無(wú)定論[2-3]，主要原因是精子形態(tài)多樣性，造成精子評(píng)估困難，另外形態(tài)學(xué)評(píng)估具有較強(qiáng)的主觀性，導(dǎo)致其對(duì)臨床結(jié)局的研究結(jié)果不一致[4]。我們前期研究[5]也顯示，在 IVF周期中精子形態(tài)與正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率以及流產(chǎn)率存在相關(guān)性。本研究進(jìn)一步探討異常形態(tài)精子(畸形率≥98%)對(duì)植入前胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響，以期改善精子活力正常但形態(tài)異常(畸形率≥98%)的患者的臨床結(jié)局。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017 年1～12月在唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心行ART治療的精子活力正常但形態(tài)異常患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<38歲；(2)不孕因素：輸卵管因素、精子形態(tài)異常(畸形率≥98%)以及不明原因不孕；(3)第1次治療周期，且促排卵方案為短效長(zhǎng)方案，獲卵數(shù)≥3個(gè)；(4)密度梯度離心法優(yōu)選后，前向運(yùn)動(dòng)(PR)精子≥90%且精子濃度≥2.0×106/ml。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵母細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重異常；(2)配子凍融周期；(3)遺傳學(xué)異?；蛐栊信咛シN植前遺傳學(xué)檢測(cè)；(4)精子均為圓頭精子或大頭多尾精子。

共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的290個(gè)周期，其中90個(gè)IVF周期，200個(gè)ICSI周期。另取同期精子活力正常且形態(tài)學(xué)正常(畸形率≤96%)的2 129個(gè)IVF周期做為對(duì)照組。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)精子形態(tài)分為3組：IVF對(duì)照組(畸形率≤96%，n=2 129)，IVF實(shí)驗(yàn)組(畸形率≥98%，n=90)和ICSI實(shí)驗(yàn)組(畸形率≥98%，n=200)。

2.精液質(zhì)量和精子形態(tài)分析方法和標(biāo)準(zhǔn)：所有精液樣本均嚴(yán)格按WHO《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)推薦的方法(巴氏染色法)進(jìn)行常規(guī)分析，連續(xù)計(jì)數(shù)分析200條以上精子的形態(tài)。正常精子形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)是：精子頭橢圓形，頂體區(qū)可清晰分辨，占頭部40%～70%，頂體區(qū)無(wú)大空泡，且不超過(guò)兩個(gè)小空泡，空泡大小不超過(guò)頭部20%。頂體后區(qū)不含任何空泡；中段細(xì)長(zhǎng)、規(guī)則，大小與頭部長(zhǎng)度相等；主段比中段細(xì)，均一，其長(zhǎng)度約45 μm(約為頭部長(zhǎng)度的10倍)；尾部直且均一，非卷曲，無(wú)鞭毛折斷的銳利折角。

3.治療過(guò)程：(1)促排卵以及體外受精：參考既往文獻(xiàn)[6]，采用短效長(zhǎng)方案促排卵，在B超引導(dǎo)下進(jìn)行經(jīng)陰道穿刺術(shù)取卵。取卵后3～4 h行體外授精(IVF/ICSI)。對(duì)于IVF周期可疑受精障礙的患者，加精4～6 h后，根據(jù)有無(wú)第二極體(2 PB)判斷是否受精，即無(wú)2 PB的卵母細(xì)胞認(rèn)為受精失敗。受精率<30%或完全不受精者，采用補(bǔ)救性ICSI(RICSI)技術(shù)進(jìn)行體外授精。(2)胚胎評(píng)估及胚胎移植：體外受精16～18 h后評(píng)估受精結(jié)果，IVF周期中正常受精的標(biāo)志是具有雙原核(2 PN)或單原核(1 PN)，ICSI周期中正常受精的標(biāo)志是具有2 PN。胚胎培養(yǎng)3～5 d后，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)實(shí)驗(yàn)室學(xué)組共識(shí)[7]對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，并行胚胎移植術(shù)和黃體支持。(3)妊娠結(jié)局判斷：胚胎移植4周后行超聲檢查，可見(jiàn)胎心搏動(dòng)者為臨床妊娠；妊娠在28周前終止，胎兒體重在1 000 g以下者稱(chēng)為流產(chǎn)，包括早期流產(chǎn)和晚期流產(chǎn)。

4.觀察指標(biāo)：植入前胚胎發(fā)育參數(shù)[6](受精失敗率=受精失敗周期/總周期數(shù)×100%，IVF周期正常受精率=正常受精數(shù)/卵母細(xì)胞總數(shù)×100%，ICSI周期正常受精率=正常受精數(shù)/MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)×100%，可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/正常受精數(shù)×100%)和臨床妊娠結(jié)局(種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%，臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般情況及促排卵基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)比較

本研究共納入2 419 例患者的臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析顯示：3組間不孕因素比較均存在顯著性差異(P<0.05)；ICSI實(shí)驗(yàn)組患者的年齡、不孕年限、原發(fā)不孕占比均顯著高于IVF對(duì)照組和IVF實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，而卵母細(xì)胞成熟率顯著低于IVF對(duì)照組和IVF實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情況及促排卵基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)比較[(-±s)，n(%)]

注：與IVF對(duì)照組比較，*P<0.05；與IVF實(shí)驗(yàn)組比較，#P<0.05

二、異常形態(tài)精子對(duì)植入前胚胎發(fā)育影響的單因素及Logistic多因素分析

組間比較，IVF實(shí)驗(yàn)組受精失敗率顯著高于IVF對(duì)照組(P<0.05)，ICSI實(shí)驗(yàn)組的受精失敗率為0；ICSI實(shí)驗(yàn)組正常受精率顯著高于IVF對(duì)照組和IVF實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，而IVF對(duì)照組和IVF實(shí)驗(yàn)組組間正常受精率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；IVF實(shí)驗(yàn)組可用胚胎率顯著低于IVF對(duì)照組、ICSI實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，而IVF對(duì)照組和ICSI實(shí)驗(yàn)組組間可用胚胎率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

調(diào)整不齊的基線資料(女方年齡，男方年齡，不孕年限，原發(fā)不孕占比，不孕因素，卵母細(xì)胞成熟率)，經(jīng)Logistic多因素分析，結(jié)果顯示：IVF實(shí)驗(yàn)組的受精失敗風(fēng)險(xiǎn)顯著高于IVF對(duì)照組(P=0.002)，可用胚胎率顯著低于IVF對(duì)照組(P=0.002)；ICSI實(shí)驗(yàn)組的正常受精率顯著高于IVF對(duì)照組(P=0.05)(表3)。

三、異常形態(tài)精子對(duì)妊娠結(jié)局影響的單因素及多因素分析

2 419例患者，其中新鮮周期移植784周期，臨床妊娠494周期，共403周期活產(chǎn)，活產(chǎn)失訪18周期。單因素分析結(jié)果顯示，IVF對(duì)照組與IVF實(shí)驗(yàn)組間的著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)發(fā)生率及活產(chǎn)率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；IVF對(duì)照組和ICSI實(shí)驗(yàn)組組間妊娠結(jié)局指標(biāo)比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表2 異常形態(tài)精子對(duì)植入前胚胎發(fā)育影響的單因素分析[(-±s)，n(%)]

注：與IVF對(duì)照組比較，*P<0.05；與IVF實(shí)驗(yàn)組比較，#P<0.05

表3 異常形態(tài)精子對(duì)植入前胚胎發(fā)育影響的Logistic多因素分析

注：OR/β調(diào)整變量：女方年齡、男方年齡、不孕年限、原發(fā)不孕占比、不孕因素、卵母細(xì)胞成熟率

表4 異常形態(tài)精子對(duì)妊娠結(jié)局影響的單因素分析[%]

注：與IVF對(duì)照組比較，*P<0.05

調(diào)整不齊的基線資料，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，IVF實(shí)驗(yàn)組的流產(chǎn)發(fā)生率顯著高于IVF對(duì)照組，活產(chǎn)率顯著低于IVF對(duì)照組(P<0.05)；著床率采用廣義估計(jì)方程GEE方法分析，結(jié)果顯示IVF對(duì)照組和IVF實(shí)驗(yàn)組組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。ICSI實(shí)驗(yàn)組與IVF對(duì)照組相比，妊娠結(jié)局指標(biāo)無(wú)論單因素分析還是多因素分析均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表5)。

表5 異常形態(tài)精子對(duì)妊娠結(jié)局影響的Logistic分析

注：妊娠結(jié)局指標(biāo)按分類(lèi)變量統(tǒng)計(jì)分析；*采用廣義估計(jì)方程GEE方法分析

討 論

精子形態(tài)學(xué)是反映男性生育能力的一個(gè)重要指標(biāo)[8]。既往研究認(rèn)為異常形態(tài)精子主要影響受精率和流產(chǎn)率[3，9-12]，我們前期研究結(jié)果顯示異常形態(tài)精子不僅影響IVF周期的受精率，而且和優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、流產(chǎn)率間存在相關(guān)性[5]。本研究進(jìn)一步探討異常形態(tài)精子對(duì)IVF周期的受精失敗率、可用胚胎率以及妊娠結(jié)局相關(guān)指標(biāo)的影響。另外為了避免臨界值的影響，精子畸形率為97%的患者未納入本研究，本研究以異常形態(tài)精子率≥98%(密度梯度離心后，精子活力和濃度正常)的患者為實(shí)驗(yàn)組，異常形態(tài)精子率≤96%、且采用短效長(zhǎng)方案的患者為對(duì)照組，研究異常形態(tài)精子對(duì)ART結(jié)局的影響。

本研究共納入2 419個(gè)治療周期，患者一般資料分析發(fā)現(xiàn)，與IVF對(duì)照組相比，ICSI實(shí)驗(yàn)組中男方年齡較高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著男性年齡的增長(zhǎng)、精子形成過(guò)程中組蛋白/魚(yú)精蛋白的替換，魚(yú)精蛋白PRM1/PRM2的比例發(fā)生改變，進(jìn)而影響精子質(zhì)量和形態(tài)[13-15]。因此，本研究中數(shù)據(jù)分析時(shí)，對(duì)年齡、不孕年限、不孕因素和原發(fā)不孕占比等不齊的基線資料進(jìn)行了校正。

異常形態(tài)精子對(duì)植入前胚胎發(fā)育參數(shù)影響：Logistic分析結(jié)果顯示，IVF周期中，異常形態(tài)精子(畸形率≥98%)導(dǎo)致受精失敗(受精率<30%)的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.91)是形態(tài)正常組(對(duì)照組，畸形率≤96%)的2.91倍，雖然IVF實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組受精率無(wú)顯著性差異(因?yàn)槭芫〉闹芷谶M(jìn)行了RICSI操作)，但降低了可用胚胎率。其主要原因可能：(1)異常形態(tài)精子在蛋白組學(xué)[16-18]和轉(zhuǎn)錄組學(xué)[19]與正常精子存在差異性，且魚(yú)精蛋白PRM1/PRM2的比例發(fā)生改變[14]；(2)精子外致密纖維蛋白基因、中心體相關(guān)蛋白基因、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶t等基因被證實(shí)與異常形態(tài)精子癥的發(fā)生有關(guān)[20]，遺傳學(xué)上改變影響精子的形態(tài)或功能[21]，導(dǎo)致胚胎在8細(xì)胞期胚源性基因激活出現(xiàn)異常，影響胚胎正常發(fā)育，甚至出現(xiàn)凋亡。然而，如果采用ICSI受精方式，則 RICSI發(fā)生率為0，與IVF周期(對(duì)照組)相比，正常受精率[β=0.08，95%CI(0.06，0.11)，P=0.00]提高8%，可用胚胎率[β=0.03，95%CI(-0.01，0.07)，P=0.108]提高3%，其主要原因可能是對(duì)于異常形態(tài)精子(畸形率≥98%)的患者而言，ICSI操作過(guò)程中選擇了形態(tài)正常的精子進(jìn)行顯微受精，獲得了較高的受精率和穩(wěn)定的可用胚胎率。在IVF周期，因減少了體內(nèi)受精過(guò)程中宮頸粘液、輸卵管等對(duì)精子的有效篩選，導(dǎo)致異常形態(tài)精子與卵母細(xì)胞結(jié)合，影響后續(xù)受精及胚胎發(fā)育[9]。因此，對(duì)于異常形態(tài)精子(畸形率≥98%)患者，精子形態(tài)異常增加了受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)，降低了可用胚胎率。采用ICSI受精方式，則選擇了形態(tài)正常精子，可以改善種植前胚胎發(fā)育參數(shù)。

異常形態(tài)精子對(duì)妊娠結(jié)局的影響：IVF實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，異常形態(tài)精子導(dǎo)致流產(chǎn)率顯著增加(21.43% vs. 9.19%)，活產(chǎn)率顯著下降(33.33% vs. 54.13%)；而采用ICSI受精方式，則可以獲得與對(duì)照組相似的妊娠結(jié)局。然而，我們的前期研究結(jié)果顯示異常形態(tài)精子組行ICSI后流產(chǎn)率增加[10]，結(jié)果差異的可能原因：(1)后期加強(qiáng)了ICSI操作中對(duì)精子形態(tài)的篩選，降低了異常形態(tài)精子對(duì)流產(chǎn)的影響[9，22]；(2)本研究中納入/排除標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格，即促排卵方案均為短效長(zhǎng)方案且為首次治療周期，減少了不同促排卵方案中由于促排卵藥物使用量對(duì)胚胎著床能力的影響[6，23]。有學(xué)者采用Meta分析方法研究異常形態(tài)精子與流產(chǎn)發(fā)生率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)精子異常形態(tài)是影響流產(chǎn)發(fā)生率的主要因素，本研究結(jié)果與其一致。然而，異常形態(tài)精子(畸形率≥98%)也存在一定的受精能力并使患者配偶獲得妊娠的可能性，因此，對(duì)于此類(lèi)患者，為了降低受精失敗風(fēng)險(xiǎn)并改善臨床結(jié)局則可以考慮采用ICSI的授精方式，但必須考慮ICSI技術(shù)的安全性。最新研究結(jié)果顯示，ICSI出生的孩子基本上安全，但是也有研究顯示ICSI后代在出生體重、先天畸形、染色體異常以及表觀遺傳變化等方面存在安全隱患，但是這些風(fēng)險(xiǎn)可能與父母本身的遺傳相關(guān)[24-26]。因此，在安全的前提下，ICSI技術(shù)可以規(guī)避異常形態(tài)精子導(dǎo)致的受精失敗風(fēng)險(xiǎn)，并改善妊娠結(jié)局指標(biāo)。然而，本研究為回顧性研究，具有一定的局限性，雖然對(duì)納入人群進(jìn)行了嚴(yán)格限制，但是實(shí)驗(yàn)組人群數(shù)目較少，需要更多的研究者提供臨床數(shù)據(jù)，進(jìn)而形成更確切的證據(jù)。

綜上所述，精子優(yōu)選后，精子活力和密度正常的患者，若異常形態(tài)精子率≥98%，采用ICSI授精方式，可以規(guī)避受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)，提高正常受精率和可用胚胎率，同時(shí)提高妊娠率和活產(chǎn)率并降低流產(chǎn)發(fā)生率。