柴胡多糖對LPS誘導心肌細胞損傷的機制研究

尹 俊 莊 紅 黃 璐 蔣 偉 代 天 張?zhí)K川

(江漢大學附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院心內科,武漢 430000)

多糖類化合物在自然界動植物中廣泛存在，其具有抗氧化、抗病毒、增強機體免疫力等多種功能[1,2]。柴胡(bupleurum)又稱山地蔬菜和草，是傘形科(umbelliferae)的多年生草本植物，主要含有柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油、脂肪油和多糖，具有疏散解熱、舒緩肝臟等功能[3,4]。多糖結構是柴胡生物活性的基礎，其為柴胡的重要活性成分之一。因此柴胡多糖的功能研究對疾病的治療具有重要意義。本研究建立LPS誘導的心肌細胞H9C2損傷模型，觀察柴胡多糖對其細胞活性、氧化應激、炎癥因子分泌的影響，揭示其機制與調控MAPK/ERK5信號通路相關，為柴胡多糖的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 乳鼠心肌細胞H9C2購自上海雅吉生物科技有限公司；柴胡飲片購自成都荷花池中藥材市場；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6檢測試劑盒均購自日本TaKaRa公司；PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海銳賽生物。

1.2方法

1.2.1細胞模型的建立及分組 柴胡多糖的提取參考林浩等[5]的方法進行提取，并配制成5、15、45、90 μg/ml 的含量，待用。參考劉丹等[6]的方法建立LPS誘導的心肌細胞損傷模型；參考武劍[7]對柴胡多糖使用劑量的研究設置柴胡多糖(5、15、45、90 μg/ml)劑量組與模型組心肌細胞共培養(yǎng)處理48 h，分別標記為5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml 柴胡多糖+LPS組。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 將細胞制成混懸液，調整密度至104個/ml，然后接種至96孔板，取100 μl細胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液上清，然后每孔加150 μl DMSO，振蕩使結晶充分溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。

1.2.3ELISA實驗檢測上清液中LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6的表達 按照LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6各自的檢測試劑盒要求檢測細胞中LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6的表達。

1.2.4Annexin V-FITC/PI流式細胞術實驗 將各組細胞，用 500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/FITC避光反應20 min后再加入5 μl的PI避光反應20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內上流式細胞儀結束檢測。細胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.2.5Western blot檢測細胞中MAPK、ERK5的蛋白表達 收集細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

2 結果

2.1不同濃度的柴胡多糖對LPS致心肌細胞活力的影響 結果如表1所示，與空白組相比，LPS組細胞活力顯著降低，LDH含量顯著升高；5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組比LPS組，細胞活力均顯著升高，LDH含量顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞活力均顯著升高，LDH含量顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞活力均顯著升高，LDH含量顯著降低(P<0.05)。

2.2柴胡多糖減少LPS致心肌細胞ROS生成 結果如表2所示，與空白組相比，LPS組細胞中ROS含量顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中ROS含量均顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中ROS含量均顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中ROS含量均顯著降低(P<0.05)。

GroupsCellviability(%/NC)LDH(U/L)NC100.00±0.00187.74±18.55LPS47.89±3.121)324.26±35.711)5μg/mlBPS+LPS56.66±3.862)283.43±32.462)15μg/mlBPS+LPS65.72±4.342)3)245.53±27.482)3)45μg/mlBPS+LPS73.86±5.822)3)4)201.86±24.122)3)4)90μg/mlBPS+LPS71.74±6.782)219.57±20.122)3)4)F140.15333.114P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

GroupsROS(U/ml)NC47.74±11.45LPS264.26±39.421)5μg/mlBPs+LPS193.43±16.352)15μg/mlBPs+LPS145.53±17.592)3)45μg/mlBPs+LPS87.86±13.822)3)4)90μg/mlBPs+LPS94.57±16.352)3)4)F71.519P0.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;Compared with LPS group,2)P<0.05;Compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；Compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

2.3柴胡多糖對LPS致心肌細胞MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影響 結果如表3所示，與空白組相比，LPS組細胞中SOD、GSH-Px顯著降低，MDA含量顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中SOD、GSH-Px均顯著升高，MDA含量顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中SOD、GSH-Px均顯著升高，MDA含量顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中SOD、GSH-Px均顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

GroupsMDA(nmol/mgport)SOD(U/mgport)GSH-Px(U/g)NC9.89±1.1683.13±4.53835.27±105.78LPS37.14±3.581)41.39±2.331)395.12±39.611)5μg/mlBPs+LPS28.17±4.072)54.27±3.722)510.74±47.832)15μg/mlBPs+LPS22.53±3.862)3)65.39±3.422)3)633.45±53.272)3)45μg/mlBPs+LPS15.43±3.402)3)4)71.87±4.832)3)4)772.52±60.592)3)4)90μg/mlBPs+LPS15.29±2.682)3)4)73.46±3.462)3)4)781.24±59.722)3)4)F46.05765.13121.647P0.0000.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

圖1 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡Fig.1 Cell apoptosis was detected by flow cytometry

2.4柴胡多糖減少LPS致心肌細胞凋亡 結果如圖1和表4示，與空白組相比，LPS組細胞凋亡率顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組凋亡率均顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組凋亡率均顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml 柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)。

2.5柴胡多糖減少LPS致心肌細胞TNF-α和IL-6的生成 結果如表5所示，與空白組相比，LPS組細胞中TNF-α、IL-6均顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中TNF-α、IL-6均顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中TNF-α、IL-6均顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中TNF-α、IL-6均顯著降低(P<0.05)。

GroupsCellapoptosisrate(%)NC6.59±0.81LPS21.35±1.931)5μg/mlBPs+LPS18.62±1.682)15μg/mlBPs+LPS15.73±1.542)3)45μg/mlBPs+LPS12.52±1.392)3)4)90μg/mlBPs+LPS12.46±1.432)3)4)F36.140P0.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

GroupsTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)NC24.89±7.4533.25±5.98LPS231.14±20.561)364.26±32.681)5μg/mlBPs+LPS182.17±18.192)253.43±18.272)15μg/mlBPs+LPS 135.53±14.462)3) 175.53±14.742)3)45μg/mlBPs+LPS 67.86±10.242)3)4) 77.86±8.832)3)4)90μg/mlBPs+LPS 79.38±8.742)3)4) 84.57±7.462)3)4)F89.661159.135P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

圖2 檢測心肌細胞中MAPK和ERK5的表達Fig.2 Detected expressions of MAPK and ERK5 in cardiac myocytes

GroupsMAPKERK5NC0.39±0.040.72±0.04LPS0.85±0.061)0.35±0.061)5μg/mlBPs+LPS0.67±0.072)0.53±0.052)15μg/mlBPs+LPS0.54±0.062)3)0.67±0.042)3)45μg/mlBPs+LPS0.36±0.042)3)4)0.79±0.062)3)4)90μg/mlBPs+LPS0.38±0.042)3)4)0.82±0.062)3)4)F41.13034.502P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

2.6柴胡多糖抑制心肌細胞MAPK和ERK5表達 結果如圖2、表6所示，與空白組相比，LPS組細胞中MAPK蛋白表達量顯著升高，ERK5蛋白表達量顯著降低；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中MAPK蛋白表達量均顯著降低，ERK5蛋白表達量均顯著升高；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中MAPK蛋白表達量均顯著降低，ERK5蛋白表達量均顯著升高；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml 柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細胞中MAPK蛋白表達量均顯著降低，ERK5蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)。

3 討論

柴胡多糖是在中藥柴胡中提取的一種混合多糖，主要由以下6種多糖組成：D-木糖、核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖或L鼠李糖、L-阿拉伯糖，具有較強的抗?jié)?、抗病毒、增強免疫力的作用[8]。王雪峰等[9]通過CVB3m感染建立小鼠心肌損傷模型，通過柴胡、黃芩提取物治療后發(fā)現，小鼠的死亡率明顯降低，并且小鼠的心肌組織有明顯好轉，說明柴胡、黃芩提取物對小鼠心肌損傷具有明顯的治療作用。劉建和等[10]發(fā)現，柴胡三參膠囊對缺血再灌注大鼠具有保護作用，其通過調控血清心肌酶和MDA的水平發(fā)揮作用。本研究通過LPS建立大鼠心肌細胞損傷模型，運用MTT法檢測柴胡多糖對受損心肌細胞活力的影響，發(fā)現柴胡多糖可呈濃度依賴性增強細胞活力，LDH含量顯著降低，說明柴胡多糖對心肌損傷具有保護作用，這與前人的研究結果均相一致，但其發(fā)生作用的機制尚未十分清楚。

心肌損傷的機制包括氧化應激、炎性反應、細胞凋亡及線粒體損傷等，其中氧化應激和炎性損傷是最重要的病理過程[11,12]。韋迎娜等[13]在心肌炎的研究中報道，槲皮素可上調心肌炎乳鼠血清中SOD表達水平，下調MDA和LDH的表達水平，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、iNOS的表達水平，并且失活TGF/NF-κB信號通路，發(fā)揮抗氧化應激和抗炎的保護作用，降低乳鼠的死亡率。本研究檢測發(fā)現柴胡多糖治療的心肌細胞中氧化應激因子ROS、MDA的含量明顯降低，SOD、GSH-Px的含量明顯升高，細胞核陽性比率明顯降低，說明柴胡多糖具有很好的抗氧化應激功能；進一步研究發(fā)現，柴胡多糖治療的心肌細胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量均顯著降低，說明柴胡多糖具有明顯的抗炎作用，這些結果揭示了柴胡多糖在心肌損傷中通過抗氧化應激和抗炎作用發(fā)揮治療作用，為柴胡多糖在心血管疾病中的治療奠定了堅實的基礎。

MAPK途徑由一系列相關蛋白激酶組成，其中ERK1/2(MAPK3/MAPK1)受到最多關注[14-17]。然而，ERK5(MAPK7)與ERK1/2共享許多特性和一些功能，但在分析MAPK在癌發(fā)生中的作用和惡性腫瘤的治療方法時，容易忽略。另外，最近對ERK5在器官發(fā)育和細胞分化中的功能探索日益增多，尤其是ERK5在心血管發(fā)育過程中的功能[18]。Vassalli等[19]在缺血再灌注心肌損傷的研究中發(fā)現p38 MAPK異常活化，促進心肌炎性損傷。韋靈等[20]在研究中發(fā)現，在LPS誘導的心肌細胞損傷中MAPK 的mRNA和蛋白表達均發(fā)生上調，ERK5的mRNA和蛋白表達均發(fā)生下調，而經過氧化苦參堿治療能夠逆轉LPS誘導的心肌細胞中MAPK、ERK5的表達，說明MAPK/ERK5信號通路在心肌損傷中具有重要作用。本研究通過Western blot檢測了LPS誘導的心肌細胞中MAPK、ERK5的蛋白表達，發(fā)現其中MAPK蛋白表達量明顯上調，ERK5蛋白表達量明顯下調，這與前人的研究結果均一致，再次驗證了MAPK/ERK5信號通路在心肌損傷中的重要性。深入研究發(fā)現，柴胡多糖可呈濃度依賴性逆轉LPS對心肌細胞損傷中MAPK、ERK5表達的影響，說明柴胡多糖具有下調MAPK、上調ERK5的功能，推測柴胡多糖發(fā)揮作用的機制可能與調節(jié)MAPK/ERK5信號通路密切相關。綜上所述，柴胡多糖對LPS誘導的心肌炎具有抗氧化和抗炎的功能，其機制與調控MAPK/ERK5信號通路相關，為柴胡多糖的臨床應用提供參考。