依達(dá)拉奉對急性腦梗死大鼠的保護(hù)作用及生長分化因子15的影響①

焦光美 單海雷 馬 征 張曉璇 康玲伶 竇志杰 王 東 楊 寧 趙 亮

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,承德 067000)

急性腦梗死是一個嚴(yán)重威脅生命及生活質(zhì)量的因素，尤其對于老年人及三高人群，是導(dǎo)致死亡和致殘的主要原因。該病變給患者及其家庭造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及精神負(fù)擔(dān)，因此也引起了社會的廣泛關(guān)注[1]。急性腦梗死會造成機(jī)體多方面的損傷。缺血性腦卒中損傷中氧化應(yīng)激是一個重要而持續(xù)造成損傷的機(jī)體反應(yīng)，依達(dá)拉奉是臨床上常用的一種自由基清除劑，在腦梗死急性期的臨床治療上有著較廣泛的應(yīng)用[2,3]。依達(dá)拉奉可逆轉(zhuǎn)自由基誘發(fā)的細(xì)胞毒性作用從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并可保護(hù)脂質(zhì)的氧化和避免細(xì)胞內(nèi)皮進(jìn)一步受損，起到減小梗死體積、減輕腦水腫、延遲神經(jīng)元凋亡，避免神經(jīng)功能過度損傷的作用。雖然臨床應(yīng)用廣泛，但對于依達(dá)拉奉的作用機(jī)制仍然有很大的研究空間[4,5]。生長分化因子15(growth differentiation factor-15，GDF-15)是TGF-β超級家族中的一員，是反映心血管生理病理進(jìn)程的獨立性生化標(biāo)志物，并且與冠心病、心肌梗死關(guān)系密切。研究表明，GDF-15與多種心腦血管疾病的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)[6]?；诖?，本研究針對依達(dá)拉奉對急性腦梗死大鼠(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的保護(hù)作用是否與調(diào)節(jié)GDF-15的表達(dá)有關(guān)進(jìn)行研究，并通過研究GDF-15下游蛋白Smad2的表達(dá)進(jìn)一步闡明在急性腦梗死中依達(dá)拉奉的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可調(diào)節(jié)MCAO腦中GDF-15及其下游蛋白Smad2的表達(dá)。本研究結(jié)果為依達(dá)拉奉臨床應(yīng)用的新作用機(jī)制提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 成年雄性SD 大鼠，SPF級，購自北京維通利華實驗動物中心[合格證號：scxk(京)2013-0008]，體重250～300 g，共66只。持續(xù)保持動物實驗設(shè)施在屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，室溫為18℃～26℃，溫差不超過4℃；維持相對濕度為40%～70%，光照每12 h替換；其余飼養(yǎng)條件都符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010規(guī)定。

1.1.2試劑與儀器 依達(dá)拉奉注射液購自吉林博大制藥有限公司，批號：02-1608102。戊巴比妥鈉購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20161114；RT-PCR試劑盒購自美國promega公司；山羊抗人GDF-15多克隆抗體、鼠抗人Smad2單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；PCR儀購自美國TeehneTouehgene公司。

1.2方法

1.2.1MCAO 模型的制作 大鼠MCAO模型復(fù)制參考 Longa 等[7]的改良線栓法，所有大鼠均以線栓栓塞左側(cè)大腦中動脈。大鼠腹腔內(nèi)注射1.5%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)進(jìn)行麻醉,仰臥位固定后,去除頸部皮毛，皮膚表面消毒后于正中縱向切口，暴露左側(cè)頸總動脈并鈍性分離，用動脈夾暫時夾閉。結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端并切斷，并將頸外動脈殘端結(jié)扎以阻止血流，松開夾閉頸總動脈的動脈夾，線栓由殘端插入頸外動脈，插入深度約17～19 mm 處，遇阻力則停止。頸前切口縫合并表面消毒。經(jīng)多普勒血流儀檢測顯示顱內(nèi)血流值低至基線值 30%以下，則表示大腦中動脈栓塞模型制備成功。假手術(shù)組動物進(jìn)行相同的操作，但僅暴露血管，不進(jìn)行栓塞。

1.2.2分組給藥 造模成功的大鼠共48只隨機(jī)分為模型組、依達(dá)拉奉低劑量組(1.5 mg/kg)、依達(dá)拉奉高劑量組(3 mg/kg)，并以假手術(shù)組作為對照。依達(dá)拉奉高、低劑量組在術(shù)后1 h給予不同劑量的依達(dá)拉奉注射液，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水，依達(dá)拉奉劑量及給藥時間參考文獻(xiàn)[8]和[9]設(shè)定，文獻(xiàn)報道尾靜脈注射依達(dá)拉奉3 mg/kg治療大鼠MCAO模型取得顯著的效果，因此我們使用依達(dá)拉奉3 mg/kg作為高劑量及參考方法使用0.5倍劑量作為低劑量探索其治療大鼠MCAO模型的機(jī)制。

1.2.3神經(jīng)功能缺損評分 大鼠大腦中動脈閉塞4、10、24 h后，雙盲法由兩名實驗人員根據(jù)改良神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評分[7]。標(biāo)準(zhǔn)：0分表示無缺陷；1分表示對側(cè)前肢不能完全伸展；2分表示對側(cè)前肢不能伸出；3分表示輕微的向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分表示嚴(yán)重的向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分表示向?qū)?cè)傾倒。

1.2.4TTC 染色及梗死體積測量 大鼠經(jīng)神經(jīng)功能缺損評分后TTC染色法進(jìn)一步驗證依達(dá)拉奉對急性腦梗死大鼠的保護(hù)作用。腹腔注1.5%戊巴比妥鈉麻醉后快速取出大腦，立即將完整腦組織放入-20℃冰箱中，經(jīng)過20 min冷凍后從前向后用大鼠腦切片模具將腦組織切成2 mm厚的腦片，共5片。將腦片輕放入預(yù)先配制的4%TTC染液中，并在37℃恒溫箱中避光染色10 min后，每隔5 min對腦片進(jìn)行晃動、翻面一次，以使得腦片著色均勻。染色均勻后將腦片放入PBS溶液中洗滌去除多余染色液，將腦片用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，24 h后即可拍照。使用Image J圖像分析軟件圈畫出梗死區(qū)域面積及全腦面積并進(jìn)行計算，梗死體積=[(梗死對側(cè)體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)體積)/梗死對側(cè)體積]×100%。

1.2.5GDF-15、Smad2 mRNA表達(dá)測定 造模24 h，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉致死，取大腦研磨后，加入Trizol 進(jìn)行裂解，采用RNA 提取試劑盒分離提取大腦中的總mRNA。測定總mRNA 濃度，符合要求后，采用cDNA合成試劑盒合成模板cDNA并進(jìn)行RT-PCR。測定GDF-15、Smad2 mRNA的表達(dá)水平。RT-PCR引物序列：GDF-15:Forward:5′-CATTGCCTAGCGAGCGACG-3′,Reverse:5′-GGTAGGCTTCGGGAGACC-3′;Smad2:Forward:5′-TCC-ACCCGGCACTACAATCT-3′,Reverse:5′-CCATCAC-CGACCATCAGACCTGG-3′。

RT-PCR實驗運用7500 system software分析結(jié)果，得出各組內(nèi)參基因和目的基因的Ct值，相對定量采用2-ΔΔCt分析方法，設(shè)定模型組中目的基因與GAPDH的相對表達(dá)量為1，計算其他組別相對應(yīng)模型組的表達(dá)量，以此表示假手術(shù)組及藥物干預(yù)組的目的基因相對表達(dá)量與模型組的差別。

1.2.6GDF-15、Smad2蛋白表達(dá)測定 造模后24 h，1.5%戊巴比妥麻醉處死大鼠，取大腦組織于蛋白裂解緩沖液中勻漿,分離提取各個大鼠大腦總蛋白?？偟鞍诐舛葴y定符合要求后，蛋白于SDS-PAGE 膠上進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉，于4℃搖床中一抗(1∶1 000)孵育過夜，PBS洗膜3次，二抗(1∶5 000) 孵育1.5 h，PBS洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像。利用化學(xué)發(fā)光熒光成像儀的MI軟件中的圖像分析功能對條帶灰度進(jìn)行分析，計算目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為半定量結(jié)果。

1.2.7蘇木素-伊紅(HE)染色 造模24 h后，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉致死，取大腦視交叉前后2 mm冠狀切片組織塊置于10%甲醛溶液中固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，厚度為4 μm，HE染色，中性樹膠封片后于LEICA DMLB型光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1依達(dá)拉奉對MCAO大鼠神經(jīng)行為的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)行為評分在缺血4、10、24 h均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，依達(dá)拉奉低、高劑量組大鼠在缺血4、10、24 h神經(jīng)行為評分均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2依達(dá)拉奉對MCAO大鼠大腦梗死面積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，依達(dá)拉奉低、高劑量組大鼠腦梗死面積顯著減少(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3依達(dá)拉奉對MCAO大鼠大腦GDF-15 和Smad2 mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦GDF-15 和Smad2 mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，依達(dá)拉奉低、高劑量組大鼠大腦GDF-15 和Smad2 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖2。

表1 依達(dá)拉奉對MCAO大鼠神經(jīng)行為的影響
Tab.1 Effect of edaravone on neurobehaviour in MCAO rats

GroupsDose(mg/kg)nNeuro-behaviour4h10h24hSham-operatedgroup-12000Modelgroup-128.60±0.881)8.00±0.971)7.60±1.151)Lowdosegroupofedaravane1.5124.90±1.062)4.50±1.352)4.30±0.882)Highdosegroupofedaravane3123.70±1.073)3.10±1.583)2.80±0.823)

Note：Compared with sham-operated group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

表2 依達(dá)拉奉對MCAO大鼠大腦梗死面積的影響
Tab.2 Effect of edaravone on cerebral infarct size in MCAO rats

GroupsDose(mg/kg)nCerebarlinfarctsize(%)Sham-operatedgroup-60Modelgroup-635.44±4.211)Lowdosegroupofedaravane1.5628.25±8.802)Highdosegroupofedaravane3624.49±5.273)

Note：Compared with sham-operated group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

圖1 各組大鼠大腦的梗死面積Fig.1 Infarct size of rat brain in each groupNote:A.Sham operation group；B.Model group；C.Edaravone low dose group；D.Edaravone high dose group.

圖2 各組大鼠大腦的GDF-15 和Smad2 mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of GDF-15 and Smad2 in brain of rats in each groupNote:1.Sham operated group;2.Model group;3.Low dose group of edaravane；4.High dose group of edaravane.Compared with sham-operated group,#.P<0.05,##.P<0.01;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖3 各組大鼠大腦GDF-15和Smad2的蛋白表達(dá)條帶與其統(tǒng)計Fig.3 HE staining results of rat brain in each groupNote:1.Sham-operation group；2.Model group；3.Low dose of edaravone group；4.High dose of edaravone group.Compared with sham-operartion group，##.P<0.01;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 各組大鼠大腦HE染色結(jié)果Fig.4 Protein bands of GDF-15 and Smad2 in brain of rats in each group and their statistical mapsNote:A.Sham-operation group;B.Model group;C.Low dose group of edaravane;D.High dose group of edaravane.

2.4依達(dá)拉奉對MCAO大鼠大腦GDF-15 和Smad2 蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦GDF-15 和Smad2的蛋白表達(dá)水平明顯升高；與模型組比較，依達(dá)拉奉低、高劑量組大鼠大腦GDF-15和Smad2蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖3。

2.5依達(dá)拉奉對MCAO大鼠大腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響 圖4結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦組織未見結(jié)構(gòu)異常。模型組各個大鼠大腦皮質(zhì)均見有缺血區(qū)病灶、淡染、組織結(jié)構(gòu)紊亂；大腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞；腦組織充血、水腫。部分樣本見神經(jīng)組織壞死、液化形成的圓形或卵圓形、邊界清楚的鏤空篩網(wǎng)狀軟化灶，腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞體縮小、尼氏小體消失、細(xì)胞間隙增寬。依達(dá)拉奉低、高劑量組，大腦皮質(zhì)亦見有缺血區(qū)病灶，淡染，組織結(jié)構(gòu)紊亂程度較模型組有改善，部分樣本均見大腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞；樣本也觀察到神經(jīng)組織壞死、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞體縮小、細(xì)胞間隙增寬等情況。病變程度較模型組輕。依達(dá)拉奉高劑量組病變程度較模型組及低劑量組輕。

3 討論

急性腦梗死，包括缺血性和出血性腦梗死，都有著極高的致殘率和致死率[1]。依達(dá)拉奉是日本三菱制藥有限公司開發(fā)的自由基清除劑，并于2001年上市[2,10]。由于依達(dá)拉奉低脂溶性高，容易通過血腦屏障到達(dá)腦組織，因此對于腦缺血后的腦神經(jīng)組織具有強(qiáng)大的保護(hù)作用，作為一種有效的腦神經(jīng)保護(hù)劑廣泛應(yīng)用于臨床[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)制主要是清除自由基、降低脂質(zhì)過氧化，并能調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮等免受過氧化損傷[11-14]。腦梗死后可誘發(fā)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，JNK磷酸化程度升高，使得神經(jīng)元損傷加重，依達(dá)拉奉的治療可明顯抑制MAPK通路 JNK的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激后神經(jīng)元的損傷[15]。出血事件通常會引起血腦屏障的損傷，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMPs)大量增加，而MMP-9的大量增加會進(jìn)一步加劇神經(jīng)元損傷、凋亡及血腦屏障受損，依達(dá)拉奉干預(yù)后，可使血清中MMP-9的含量明顯降低，使得缺血性腦梗死后的血腦屏障受損程度降低[16]。

GDF-15是TGF-β細(xì)胞因子超家族的一個成員，廣泛表達(dá)于各組織中，被認(rèn)為是心血管生理病理過程的獨立生化標(biāo)記物，其含量的大量升高可反映冠心病、急性腦梗死、心肌梗死等嚴(yán)重病變的發(fā)生[17]。多項研究表明，隨著急性腦梗死病情的加重，GDF-15的表達(dá)水平顯著升高，大量的GDF-15浸潤病變組織相關(guān)的神經(jīng)元，使神經(jīng)元受損[6，18]。此外，GDF-15參與腦梗死后大腦的應(yīng)激反應(yīng)，使得炎癥反應(yīng)加劇[18]。從多方面看，降低腦梗死后GDF-15的表達(dá)水平對腦神經(jīng)組織的保護(hù)有著十分重要的意義。本研究針對這個方面，研究依達(dá)拉奉對急性腦梗死腦神經(jīng)損傷的保護(hù)機(jī)制是否與GDF-15表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。結(jié)果顯示大鼠MCAO造模后，大腦中切片可見明顯的梗死區(qū)，且神經(jīng)行為學(xué)評分明顯升高，腦組織病變程度嚴(yán)重，可見造模成功，而該MCAO大鼠大腦中GDF-15及其下游信號分子Smad2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，該結(jié)果與目前報道的結(jié)果一致。當(dāng)機(jī)體受到損傷時，受損區(qū)域會釋放TGF-β，其與細(xì)胞表面的受體結(jié)合可正反饋促使TGF-β磷酸化，該效應(yīng)會激活Smad通路，而Smad通路也受GDF-15調(diào)節(jié)，有研究顯示急性腦梗死后Smad2的表達(dá)水平明顯升高[19]。給予不同劑量的依達(dá)拉奉干預(yù)后，大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分明顯下降，腦梗死面積明顯減少，且腦組織病變程度大大減輕，同時，腦組織中GDF-15及其下游信號分子Smad2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降，且以3 mg/kg劑量更為明顯。該結(jié)果可能與腦梗死后使用依達(dá)拉奉的治療時間有關(guān)，有研究顯示在急性腦梗死后1～3 h使用依達(dá)拉奉的腦神經(jīng)保護(hù)作用較好，而依達(dá)拉奉靜脈給藥劑量達(dá)到3 mg/kg能有較顯著的療效[8]。

依達(dá)拉奉臨床應(yīng)用有十多年，而其作用機(jī)制仍有很大的研究空間。明確的作用機(jī)制對于臨床藥物應(yīng)用有十分重要的意義，本研究為依達(dá)拉奉臨床治療急性腦梗死的治療機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，依達(dá)拉奉或可用于其他GDF-15升高的病變治療，但仍需更多的證據(jù)支持。