依托咪酯通過miR-146a調節(jié)TLR4通路對內毒素急性肺損傷小鼠炎癥反應的保護作用研究

安 靜 張 睿 劉曉樂

(河南省省立醫(yī)院麻醉科，鄭州 450000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)發(fā)病機制非常復雜，多數是由于機體處于創(chuàng)傷、嚴重感染、中毒、休克或吸入毒性氣體等產生的急性的、進行性的低氧性呼吸功能衰竭，后期會引發(fā)多臟器功能障礙，甚至導致死亡。有報道稱，ALI死亡率高達40%以上[1]。脂多糖誘導的急性肺損傷死亡率較高，而Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)家族中的TLRs4是脂多糖的受體，它與先天性免疫系統(tǒng)關系密切。miR-146a隸屬于miR-146家族，在天然免疫過程中發(fā)揮著負反饋調節(jié)的作用，能夠調節(jié)多種炎性因子的表達，從而達到控制炎癥的目的[2]。依托咪酯作為一種咪唑類衍生的非巴比妥類短效全身麻醉藥，是臨床上常用的麻醉性藥物，它對腎上腺皮質功能有一定的抑制作用，而腎上腺皮質對機體的炎性反應有調節(jié)作用，依托咪酯通過對基因水平的調控，可以增強體內抗炎因子的基因轉錄和合成，抑制致炎因子的基因轉錄和合成，從而能有效降低手術患者體內的炎性因子水平。但是依托咪酯在麻醉過程中對患者體內炎性因子的影響機理尚不明確，本實驗通過研究依托咪酯干預導致體內高表達miR-146a，從而調節(jié)TLR4通路達到控制內毒素急性肺損傷小鼠炎癥反應的作用，并為ALI臨床預防和治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料 LPS購自美國Sigma公司；依托咪酯(20 mg/10 ml國藥準字：H32022992)購自江蘇恩華；TNF-α、IL-6和 IL-1β檢測試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司；超凈工作臺購自天津醫(yī)藥凈化設備廠；梯度PCR儀購自德國Biometre公司；DU800核酸蛋白分析儀購自德國BECKMAN COULTER公司；BALB/c 小鼠 80只，雄性，12周，體重(20±2)g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號：scxk (粵)2008-0002；所有操作均符合《實驗動物管理條例》。蛋白提取試劑購自北京索萊寶科技有限公司；一抗購自美國Abcam公司；Trizol Reagent購自大連TaKaRa生物技術公司；RNA逆轉錄試劑盒購自昆明倍捷科技有限公司；SYRB Real-time PCR 試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司；辣根標記羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗小鼠TLR4抗體購自美國Santa公司；DNA及蛋白maker、引物購自大連寶生物公司；Western blot檢測設備購自北京新諾立華儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型制作與分組 SPF級別BALB/c雄性小鼠60只，隨機分為空白對照組、模型組、依托咪酯組，每組20只。參照文獻[3]對所有小鼠實驗前禁食12 h，不禁水。模型組及藥物干預組給予腹腔注射LPS，濃度2 mg/ml，約200 μl/只 (20 mg/kg)?？瞻讓φ战M給予等體積生理鹽水腹腔注射。注射LPS后，小鼠出現呼吸頻率加快，活動力降低，拒絕飲水，寒戰(zhàn)，無力逃避，毛發(fā)聳立，解稀水樣便。

1.2.2實驗動物給藥方式 藥物干預組于造模后0.5 h給予依托咪酯，依托咪酯劑量則根據人、小鼠等效劑量換算，換算后給藥劑量為2.5 mg/kg?？瞻讓φ战M及模型組給予等體積生理200 μl/只。

1.2.3標本采集及檢測方法

1.2.3.1內毒素含量檢測 于給藥后6 h采用摘除眼球取血法，收集約0.5 ml血液，離心后留取富含血小板的血漿，應用動態(tài)濁度法-血漿內毒素檢測試劑，將血漿加入到內毒素檢品處理液中，應用LPS檢測分析得出數據。

1.2.3.2RT-PCR檢測miR-146a、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺組織中的表達 根據Trizol法提取總RNA，將抽取的RNA取500 ng經逆轉錄成cDNA，以 cDNA產物為模板，用Real-time PCR法檢測 miR-146a，MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達。MyD88引物：上游：5′-GGACTGCCAGAAATACATACGC-3′；下游：5′-CTTTGTCTGTGGGACACTGCTC-3′；產物長度為94 bp，退火溫度為52℃。IRAK1引物：上游：5′-GCTCCCAGACCCATTCTGAG-3′；下游：5′-CTCTGGGCTTGGCTT-GATGG-3′；產物長度為96 bp，退火溫度為60℃。IRF5引物：上游：5′-ATGATTACGTTCTGGGAG-AAGA-3′；下游：5′-TCTTTGGGTAAGGAATAGGGTG-3′；產物長度為205 bp，退火溫度為52℃。TRAF6引物：上游：5′-AAGTTGCCGAGATGGAAGC-3′；下游：5′-CCAGGGCTATGAATGACCAC-3′；產物長度為118 bp，退火溫度為59℃。Real-time PCR 擴增條件為：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 45 s，共 40個循環(huán)，實驗重復3次。以miR-39、U6和GAPDH作為內參照。

1.2.3.3Western blot檢測TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRF5蛋白在肺組織中的表達 取實驗小鼠肺組織經處理后離心提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據目的蛋白分子量大小選取8%或10%的分離膠進行分離，取30 μg樣本上樣，進行彩染蛋白分子量指示SDS-聚丙烯酰胺凝膠，大小10 cm×10 cm，經80 V恒壓分離30 min后調至120 V恒壓，當蛋白指示劑移動至分離膠底部時再用300 mA恒流電旋轉75 min，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。兔抗小鼠TLR4抗體、兔抗小鼠MyD88抗體、兔抗小鼠TRAF6抗體、兔抗小鼠IRAK1抗體、兔抗小鼠IRF5抗體4℃分離過夜，TBST洗滌3次，二抗孵育1 h后ECL顯色，曝光拍照，Tannon Gis軟件分析曝光底片光密度值。

2 結果

2.1各組小鼠一般情況 各組小鼠無中途脫落。空白對照組小鼠活動及進食及外界刺激反應正常。模型組及依托咪酯組小鼠在應用LPS后，出現呼吸頻率加快、活動力下降，進食減少，對外界刺激反應差等，但兩組比較，模型組癥狀明顯較重，出現呼吸窘迫、寒戰(zhàn)、拒絕食水。

2.2小鼠血清內毒素(ET)含量 空白對照組小鼠血清內毒素含量非常低，但模型組、依托咪酯組與空白對照組，血清內毒素含量明顯升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明造模成功，存在內毒素損傷。依托咪酯組與模型組比較，依托咪酯組小鼠血清內毒素含量下降，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，表明依托咪酯具有減輕內毒素損傷的作用。具體見圖1。

2.3BALF中TNF-α、IL-6 和 IL-1β的含量 空白對照組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6 和IL-1β含量非常低，但模型組、依托咪酯組與空白對照組，TNF-α、IL-6和 IL-1β含量明顯升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明LPS誘導小鼠肺臟產生急性炎癥反應，炎性細胞因子產生增多。與模型組比較，依托咪酯組TNF-α、IL-6和IL-1β含量下降，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，表明依托咪酯具有減輕急性肺損傷炎癥反應，降低炎性細胞因子作用。具體見圖2。

2.4miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺組織中的表達 空白對照組小鼠肺組織可以檢測到一定水平的miR-146a表達。模型組、依托咪酯組小鼠肺組織中miR-146a表達水平較空白對照組明顯升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，依托咪酯組miR-146a表達水平更高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。空白對照組小鼠肺組織中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達，但模型組、依托咪酯組與空白對照組比較，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達水平上調(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，依托咪酯組TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達水平下降(P<0.05)差異有統(tǒng)計學意義。具體見圖3。

圖1 小鼠血清內毒素含量(ELISA)Fig.1 ET concentration in blood serum(ELISA)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

圖2 肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量(ELISA)Fig.2 TNF-α,IL-6 and IL-1β concentration in bronchoalveolar lavage fluid(ELISA)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

圖3 肺組織中miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA的表達(RT-PCR)Fig.3 miR-146a,TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 relative expression in lung tissue of mice(versus LPS)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 verus LPS.

圖4 肺組織中TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白的表達(WB)Fig.4 TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 protein expression in lung tissue of mice(WB)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

圖5 肺組織中TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白的表達(WB)Fig.5 TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 protein expression in lung tissue of mice(WB)

2.5TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRF5蛋白在肺組織中的表達 空白對照組小鼠肺組織中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白表達，但模型組、依托咪酯組與空白對照組比較，表達水平明顯上調，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，依托咪酯組表達水平下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。具體見圖4、5。

3 討論

TLRs是人體先天免疫的重要組成部分，調控其表達可以促進附近臟器的炎癥修復。TLR4作為TLRs家族中發(fā)現最早的受體之一，可以識別細菌中LPS，在內毒素耐受中發(fā)揮重要的作用。當正常細胞受到感染刺激時釋放的LPS和CD14相結合，然后與TLR4聚合后活化使得信號轉導到細胞內，活化后的TLR4與MyD88結合并活化，活化后的MyD88與IL-1受體相關激酶(IRAK)相結合，從而導致IRAK磷酸化，進而激發(fā)TNF受體相關因子-6(TRAF-6)釋放，最終導致相關基因發(fā)生轉錄、翻譯，從而導致炎性因子釋放。如果能夠影響細胞內外的TLR4水平來阻斷TLR4傳遞LPS信號通路，可以有效抑制內毒素產生的炎癥反應。miR-146是在免疫系統(tǒng)中發(fā)現具有調控作用microRNA，分為miR-146a和miR-146b兩種，分別位于人類基因的第五號和第十號染色體上，在小鼠基因中位于第十一號和第十九號染色體上[4]。miR-146a和miR-146b僅有兩個核酸序列不同，近年來對miR-146a研究較多，發(fā)現miR-146a與NF-κB通路相連，廣泛參與了腫瘤、炎癥等生命活動[5-7]。miR-146a作為一種炎癥保護性因子可以在多個水平上調控TLR4信號通路，主要表現在：①miR-146a可以調控TLR4的表達；②miR-146a可以作用于TLR4中的信號通路分子，如IRAK1、IRF5、TRAF6，抑制其釋放；③miR-146a作用于TLR信號通路調節(jié)基因，通過多條途徑調控TLR4通路，從而抑制TLR4的促炎癥通路[8-10]。

本研究中，通過LPS誘導建立急性肺損傷小鼠模型，并給予依托咪酯進行干預，發(fā)現依托咪酯組與模型組比較，依托咪酯組小鼠血清內毒素含量明顯下降，表明依托咪酯具有減輕內毒素損傷的作用。通過對BALF中TNF-α、IL-6和 IL-1β的含量測定，發(fā)現模型組、依托咪酯組與空白對照組，TNF-α、IL-6和 IL-1β含量明顯升高，說明LPS誘導小鼠肺臟產生急性炎癥反應，炎性細胞因子產生增多。與模型組比較，依托咪酯組TNF-α、IL-6和IL-1β含量下降，表明依托咪酯具有減輕急性肺損傷炎癥反應，降低炎性細胞因子作用。通過檢測miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺組織中的表達發(fā)現，空白對照組小鼠肺組織可以檢測到一定水平的miR-146a表達；模型組、依托咪酯組小鼠肺組織中miR-146a表達水平較空白對照組明顯升高，與模型組比較，依托咪酯組miR-146a表達水平更高，同時發(fā)現空白對照組小鼠肺組織中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達，但模型組、依托咪酯組與空白對照組比較，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達水平上調，與模型組比較，依托咪酯組TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達水平下降。模型組、依托咪酯組與空白對照組比較TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白表達水平明顯上調，與模型組比較，依托咪酯組TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6表達水平明顯下降。綜上研究發(fā)現，模型組炎癥因子及TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA水平明顯上調，提示ALI的發(fā)生于炎癥因子及TLR4有關。和模型組相比，依托咪酯組可以明顯提高miR-146a含量，同時依托咪酯組的炎癥因子水平較模型組明顯下降，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達水平較模型組明顯下降，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6表達水平較模型組明顯下降，說明依托咪酯能夠通過提高miR-146a含量進而調節(jié)TLR4通路，抑制TLR4表達水平，對LPS誘導的MyD88、TRAF6等mRNA及蛋白的表達有明顯的抑制作用。

本研究表明，依托咪酯可以提高炎癥保護性因子miR-146a的含量，進而調節(jié)TLR4通路對內毒素急性肺損傷小鼠炎癥反應的保護作用。但該研究結果有待更大樣本動物實驗的驗證，具體的作用機制有待進一步研究。