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      腦梗死大鼠腦組織生長分化因子-15的表達(dá)及其與神經(jīng)功能損害的關(guān)系①

      2020-02-20 10:54:20焦光美單海雷康玲伶張曉璇竇志杰馮亞茹
      中國免疫學(xué)雜志 2020年2期
      關(guān)鍵詞:腦組織引物腦梗死

      焦光美 單海雷 康玲伶 張曉璇 馬 征 竇志杰 趙 亮 馮亞茹 楊 寧

      (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,承德 067000)

      腦梗死是常見的腦血管疾病,是由于腦供血不足引起的腦組織缺血性壞死,腦梗死在中老年人群中高發(fā),隨著我國人口的不斷老齡化,腦梗死的發(fā)生率有不斷上升趨勢;以動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的腦梗死是最常見的病理類型[1],血管壁炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段具有重要作用,與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥因子越來越受到重視,GDF-15與發(fā)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員之一,是一種應(yīng)激蛋白,在心腦血管疾病、炎癥、腫瘤等情況下GDF-15水平升高[2],研究發(fā)現(xiàn)GDF-15與心肌梗死等心血管疾病關(guān)系密切[3,4],關(guān)于GDF-15與腦梗死的研究較少,有研究發(fā)現(xiàn)血清GDF-15與急性缺血性腦卒中關(guān)系密切,而GDF-15在腦梗死組織中的表達(dá)及其在腦梗死發(fā)生中的機(jī)制尚不十分清楚。本文通過建立腦梗死大鼠模型,研究腦梗死大鼠腦組織中GDF-15表達(dá)情況及意義。

      1 材料與方法

      1.1材料

      1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠45只,雄性,體重230~250 g,購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SYXK(京)2014-0017。

      1.1.2主要試劑 伊紅、蘇木素等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),GDF-15單克隆抗體、Smad2單克隆抗體、Smad4單克隆抗體、p21單克隆抗體、GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體、BCA試劑盒(美國Gibco公司)。

      1.2方法

      1.2.1動(dòng)物分組及建模 45只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為腦梗死組、假手術(shù)組和正常對(duì)照組,每組15只,腦梗死組大鼠采用線栓法制作腦梗死動(dòng)物模型:大鼠麻醉后仰臥固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上,暴露頸部皮膚,消毒后剪開頸部皮膚,分離大鼠頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈以及頸外動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎,頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和頸總動(dòng)脈近心端放置動(dòng)脈夾,剪斷頸外動(dòng)脈結(jié)扎處,插入栓線至頸內(nèi)動(dòng)脈處,將頸內(nèi)動(dòng)脈夾打開繼續(xù)推進(jìn)栓線至遇到阻力為止,阻斷大腦中動(dòng)脈血流,固定栓線、縫合皮膚,2 h后拔出栓線。假手術(shù)組大鼠暴露頸內(nèi)動(dòng)脈后直接縫合皮膚。正常對(duì)照組不予處理。大鼠建模后表現(xiàn)為右側(cè)轉(zhuǎn)圈障礙、右前爪不能伸展,表明腦梗死模型建立成功。建模后腦梗組大鼠死亡2只,存活13只;假手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠無異常表現(xiàn),兩組15只均存活。

      1.2.2大鼠神經(jīng)功能mNSS評(píng)分 建模后1周,對(duì)各組大鼠進(jìn)行感覺、運(yùn)動(dòng)、反射活動(dòng)、平衡木四個(gè)方面的神經(jīng)功能mNSS評(píng)分測定,mNSS評(píng)分為0~18分,分值越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

      1.2.3大鼠腦組織采集 各組大鼠神經(jīng)功能mNSS評(píng)分測定后,麻醉各大鼠,麻醉成功后,將大鼠固定到手術(shù)臺(tái)上,斷頭取各大鼠腦組織進(jìn)行HE染色、Western blot和RT-PCR測定。

      1.2.4大鼠腦組織HE染色 將各大鼠腦組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,切成厚4 μm厚切片,經(jīng)甲醛固定,常規(guī)進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察各大鼠腦組織病理學(xué)變化,并進(jìn)行TTC染色測量腦梗死面積。每只大鼠取5個(gè)視野計(jì)算腦梗死面積,腦梗死面積以腦梗死面積/腦組織總面積×100%表示。

      1.2.5大鼠腦組織中GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平測定 將各組大鼠腦組織放入EP管中,加入蛋白裂解液研磨均勻,反應(yīng)30 min,13 000 r/min離心15 min,留取上清液,采用BCA法測定蛋白濃度,采用Western blot法測定大鼠腦組織中GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平,以GDF-15單克隆抗體、Smad2單克隆抗體、Smad4單克隆抗體為一抗、p21單克隆抗體為一抗,以GAPDH為內(nèi)參照,以羊抗鼠抗體作為二抗進(jìn)行Western blot測定。GDF-15、Smad2、Smad4p21蛋白的相對(duì)表達(dá)量=GDF-15、Smad2、Smad4p21蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

      1.2.6大鼠腦組織中GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平測定 將各組大鼠腦組織標(biāo)本研磨成粉末,再加入Trizol研磨,收集懸液,提取腦組織總RNA,采用RT-PCR測定腦組織中GDF-15(上游引物:5′-AGGTGTGTTGAGAGGATGAGAGATATTAG-3′,下游引物:5′-AAAACAATCATCCTTATCC-AAAACCT-3′)、Smad2(上游引物:5′-CCATCCCCGACAAGACTAACTT-3′,下游引物:5′-TGGTGGTCGATAGTTTGTCCAT-3′)、Smad4(上游引物:5′-ACCAACTTCCCTAACTTTCCT-3′,下游引物:5,-ACTATGGCTCGGTGCGAGAA-3′)、p21(上游引物:5′-GAGAACTCGGGACCGCTTTC-3′,下游引物:5′-TCCTGAGCGTGTTTGCTGTC-3′) mRNA水平,PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;95℃ 10 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s,共42個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。

      2 結(jié)果

      2.1各組大鼠腦組織HE染色 腦梗死組大鼠腦組織水腫,腦細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核仁模糊,小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多,腦梗死面積為20.13%;假手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠腦組織未見明顯異常。見圖1。

      圖1 各組大鼠腦組織HE染色(×100)Fig.1 Morphology of brain tissue of rats in various groups (HE,×100)Note:A.Cerebral infarction group;B.Sham operation group;C.Normal control group.

      2.2各組大鼠mNSS評(píng)分比較 腦梗死組大鼠建模后表現(xiàn)為右側(cè)轉(zhuǎn)圈障礙、右前爪不能伸展,表明腦梗死模型建立成功,死亡2只,存活13只;假手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠無異常表現(xiàn),每組15只均存活。三組大鼠mNSS評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=397.354,P<0.001),其中腦梗死組大鼠mNSS評(píng)分[(11.43±2.14)分]明顯高于假手術(shù)組[(0.45±0.07)分]和正常對(duì)照組[(0.43±0.09)分](P<0.05),假手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠mNSS評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

      2.3各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比較 腦梗死組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4蛋白水平高于假手術(shù)組和正常對(duì)照組(P<0.05),p21蛋白水平低于假手術(shù)組和正常對(duì)照組(P<0.05),假手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

      2.4各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比較 腦梗死組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4 mRNA水平高于假手術(shù)組和正常對(duì)照組(P<0.05),p21 mRNA水平低于假手術(shù)組和正常對(duì)照組(P<0.05),假手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

      表1 各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比較

      Tab.1 Levels of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue in various group rats

      GroupsnProtein relative expressionGDF-15Smad2Smad4p21Cerebral infarction group130.54±0.230.63±0.210.77±0.260.23±0.06Sham operation group150.11±0.051)0.25±0.131)0.31±0.171)0.57±0.211)Normal control group150.12±0.041)0.23±0.121)0.32±0.151)0.55±0.191)F value 47.35628.58224.54216.993P value<0.001<0.001<0.001<0.001

      Note:In comparison with cerebral infarction group,1)P<0.05.

      表2 各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比較

      Tab.2 mRNA levels of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue in various group rats

      GroupsnGDF-15 mRNASmad2 mRNASmad4 mRNAp21 mRNACerebral infarction group130.73±0.181.54±0.361.42±0.410.63±0.11Sham operation group150.09±0.030.67±0.180.74±0.191.21±0.14Normal control group150.11±0.040.65±0.170.71±0.221.19±0.16F value170.02358.23027.421201.734P value<0.001<0.001<0.001<0.001

      圖2 大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot results of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue of ratsNote:A.Cerebral infarction group;B.Sham operation group;C.Normal control group.

      表3 腦梗死大鼠腦組織GDF-15蛋白水平與mNSS評(píng)分及Smad2、Smad4、p21蛋白水平的相關(guān)性

      Tab.3 Correlation between GDF-15 level in brain tissue in cerebral infarction group rats,mNSS scores and levels of Smad2,Smad4 and p21

      IndexGDF-15 proteinr valueP valuemNSS scores0.546<0.001Smad2 protein0.613<0.001Smad4 protein0.576<0.001p21 protein-0.523<0.001

      表4 腦梗死大鼠腦組織GDF-15 mRNA水平與mNSS評(píng)分及Smad2、Smad4、p21 mRNA水平的相關(guān)性

      Tab.4 Correlation between GDF-15 mRNA level in brain tissue in cerebral infarction group rats,mNSS scores and mRNA levels of Smad2,Smad4 and p21

      IndexGDF-15 mRNAr valueP valuemNSS scores0.572<0.001Smad2 mRNA0.645<0.001Smad4 mRNA0.607<0.001p21 mRNA-0.512<0.001

      2.5腦梗死大鼠腦組織GDF-15水平與mNSS評(píng)分及Smad2、Smad4、p21水平的相關(guān)性 腦梗死大鼠腦組織GDF-15蛋白水平與mNSS評(píng)分、Smad2蛋白、Smad4蛋白水平呈正相關(guān)(P<0.05),與p21蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),腦組織GDF-15 mRNA水平與mNSS評(píng)分、Smad2 mRNA、Smad4 mRNA水平呈正相關(guān)(P<0.05),與p21 mRNA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3、4。

      3 討論

      GDF-15是從人骨髓單核細(xì)胞系中分離出來的,其蛋白結(jié)構(gòu)符合TGF-β超家族成員結(jié)構(gòu),因此GDF-15為TGF-β超家族成員之一,在生理情況下,GDF-15只有在前列腺、胎盤等少數(shù)組織中表達(dá),在其他組織中不表達(dá)或表達(dá)量非常少[5,6];GDF-15為一種應(yīng)激蛋白,在腫瘤、心血管疾病、炎癥、外傷等各種應(yīng)激狀態(tài)下,GDF-15表達(dá)量明顯增加[7]。GDF-15在心血管疾病中的研究比較多,血循環(huán)中GDF-15水平升高為多種心血管疾病(包括穩(wěn)定性冠心病、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、心力衰竭等)發(fā)生心血管事件的高危因素[8-10]。GDF-15在腦血管疾病中的研究不多,盧昌均等[11]研究發(fā)現(xiàn)血清GDF-15水平與急性缺血性腦卒中關(guān)系密切;Andersson等[12]研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)中GDF-15水平與腦損傷和腦中風(fēng)關(guān)系密切。本文通過建立腦梗死大鼠模型,研究腦梗死大鼠腦組織中GDF-15表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組和正常對(duì)照組大鼠比較,腦梗死大鼠腦子中GDF-15水平升高,GDF-15水平與神經(jīng)功能缺損呈正相關(guān),考慮GDF-15與腦梗死的發(fā)生關(guān)系密切。

      Smad蛋白家族直接參與TGF-β超家族成員的信號(hào)傳導(dǎo),是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白之一,Smad蛋白家族參與細(xì)胞分化、增殖、遷移、凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng),在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[13,14];在機(jī)體受到損傷時(shí),細(xì)胞釋放TGF-β,TGF-β與細(xì)胞表面受體結(jié)合正反饋引起其他TGF-β受體磷酸化,磷酸化的TGF-β受體激活Smad信號(hào)通路,并使細(xì)胞內(nèi)的Smad2和Smad3磷酸化,并發(fā)生空間構(gòu)象變化[15,16],并與Smad4發(fā)生交聯(lián),形成異三聚體復(fù)合物,異三聚體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等[17,18]。p21是受Smad4調(diào)控的靶基因,p21水平降低可促進(jìn)細(xì)胞衰老和死亡,與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[19]。本文對(duì)GDF-15與Smad2、Smad4進(jìn)行相關(guān)性研究,發(fā)現(xiàn)腦梗死大鼠腦組織Smad2、Smad4水平升高,p21水平降低,腦組織GDF-15水平與Smad2、Smad4水平呈正相關(guān),與p21水平呈負(fù)相關(guān),因此,考慮GDF-15對(duì)腦梗死神經(jīng)功能的影響可能與Smad通路及其靶基因p21有關(guān)。

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