當(dāng)歸多糖通過(guò)調(diào)節(jié)p38通路抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲①

唐治蓉 龍瓊先 劉欣雅 廖文華 張旭乾 王勝嵐 (南充市中心醫(yī)院病理科，南充 637000)

宮頸癌也稱(chēng)子宮頸癌，是常見(jiàn)的發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的婦科惡性腫瘤，是繼乳腺癌之后的女性健康第二殺手[1]。目前，每年我國(guó)診斷出宮頸癌新發(fā)病例將近一百萬(wàn)，年死亡率高達(dá)30%以上，其發(fā)病率和死亡率還在急劇上升[2]。宮頸癌主要以手術(shù)、化療、放療三大方式治療，治療藥物主要是順鉑等，但這些治療藥物存在毒副作用大、容易讓患者產(chǎn)生耐藥性等缺陷，因此，找到新的宮頸癌治療藥物是迫切需要解決的問(wèn)題[3]。當(dāng)歸多糖(angelica polysaccharide，AP)是中藥當(dāng)歸的主要水溶成分，具有明顯地改善血液系統(tǒng)、免疫促進(jìn)、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[4]。已有研究證明，當(dāng)歸多糖能夠抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)這些細(xì)胞凋亡[5]，但當(dāng)歸多糖對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制尚不清楚。p38通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、分裂、死亡等，其以正調(diào)節(jié)的方式參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移[6]。本文主要研究當(dāng)歸多糖通過(guò)p38通路對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的影響，以期為宮頸癌的治療提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 4～6周齡，體重18～22 g雌性BALB/c裸鼠50只，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2015-030。宮頸癌Hela購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RPMI1640培養(yǎng)液(上海栩冉生物科技有限公司)，胎牛血清(素爾生物科技有限公司)，當(dāng)歸多糖(西安雨澤生物科技有限公司)，順鉑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司)，SB203580(百奧萊博生物科技有限公司)，RIPA裂解緩沖液(南京?？藸柹锟萍加邢薰?，BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司)，p-p38抗體和p38抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)，MMP-2抗體(上海戶(hù)實(shí)醫(yī)藥科技有限公司)，MMP-9抗體(上海滬崢生物科技有限公司)，二抗(維奧生物科技有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光底物(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組處理 裸鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周。在超凈工作臺(tái)內(nèi)于每只裸鼠右后肢皮下注射0.2 ml(2×107個(gè)/L)的宮頸癌Hela細(xì)胞懸液，用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫瘤體積，7 d后所有裸鼠均出現(xiàn)大于100 mm3的皮下結(jié)節(jié)，表明移植瘤模型構(gòu)建成功。將50只造模成功的裸鼠隨機(jī)分為5組：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(2 mg/kg順鉑)，低、中、高劑量當(dāng)歸多糖組(30 mg/kg、100 mg/kg、300 mg/kg)[7]，每組10只，每天腹腔給藥0.2 ml，連續(xù)21 d。脫頸法處死所有裸鼠，完整剝離移植瘤，測(cè)量移植瘤體積及質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組移植瘤重量/模型組移植瘤重量)×100%。治療期間實(shí)驗(yàn)組裸鼠死亡超過(guò)20%(2 只)或平均體質(zhì)量(去瘤后)下降>15%則認(rèn)為藥物具有毒性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 宮頸癌Hela細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下，于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置宮頸癌Hela組，陽(yáng)性對(duì)照組，當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組，SB203580組，當(dāng)歸多糖高劑量+SB203580組，其中宮頸癌Hela組細(xì)胞用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞用含有10 μmol/L順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組細(xì)胞分別用含有100、200、400 mg/L 當(dāng)歸多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)[8]，SB203580組細(xì)胞用含有10 μmol/L SB203580的培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)歸多糖高劑量+SB203580組用含有400 mg/L當(dāng)歸多糖和10 μmol/L SB203580的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，分別用各組培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，置于 37℃ 5%CO2的條件下培養(yǎng)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至 50%融合時(shí)，分別于轉(zhuǎn)染后0、12、24、36、48 h 加入20 μl MTT 溶液，再培養(yǎng)4 h，棄上清后加入150 μl DMSO，于酶標(biāo)儀490 nm 處檢測(cè)OD值。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將各組宮頸癌Hale細(xì)胞消化鋪滿(mǎn)單層后用小號(hào)槍頭垂直劃痕，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別在顯微鏡下拍照，用 Image J 軟件分析。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況 將細(xì)胞以無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代接種于用Matrigel預(yù)處理的Transwell小室中，細(xì)胞終濃度為3×105個(gè)/ml。小室上層加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，下層則加入含血清的各組培養(yǎng)液。48 h后用無(wú)菌棉簽擦去小室上層細(xì)胞，下層細(xì)胞HE染色后計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.6Western blot檢測(cè)p-p38和p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平 用RIPA裂解液提取培養(yǎng)3 d 的各組細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(p-p38 1∶500、p38 1∶1 000、MMP-2 1∶500、MMP-9 1∶500)于4℃封閉過(guò)夜，第二天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴ECL進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1當(dāng)歸多糖抑制宮頸癌移植瘤的發(fā)展 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組裸鼠均無(wú)死亡。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和當(dāng)歸多糖裸鼠移植瘤重量和體積均明顯減少，抑瘤率明顯增加，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖1)，且當(dāng)歸多糖各組隨著當(dāng)歸多糖劑量的增加，抑制效果越明顯，這說(shuō)明當(dāng)歸多糖呈劑量依賴(lài)性抑制宮頸癌移植瘤的發(fā)展。

2.2當(dāng)歸多糖抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng) 通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況可知：與宮頸癌Hela組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和當(dāng)歸多糖各組Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不同程度抑制，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)，且當(dāng)歸多糖各組隨著當(dāng)歸多糖劑量的增加，抑制效果越明顯，這說(shuō)明當(dāng)歸多糖呈劑量依賴(lài)性抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.3當(dāng)歸多糖抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲和遷移 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力發(fā)現(xiàn)：與宮頸癌Hela組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和當(dāng)歸多糖各組Hela細(xì)胞的遷移能力受到不同程度抑制，劃痕閉合率明顯降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3A)，且當(dāng)歸多糖各組隨著當(dāng)歸多糖劑量的增加，抑制效果越明顯，這說(shuō)明當(dāng)歸多糖呈劑量依賴(lài)性抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移。

通過(guò)Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況發(fā)現(xiàn)：與宮頸癌Hela組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和當(dāng)歸多糖各組Hela細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3B)，且當(dāng)歸多糖各組隨著當(dāng)歸多糖劑量的增加，降低程度越明顯，這說(shuō)明當(dāng)歸多糖呈劑量依賴(lài)性抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲。

圖1 當(dāng)歸多糖抑制宮頸癌移植瘤的發(fā)展

圖2 MTT檢測(cè)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.4當(dāng)歸多糖抑制宮頸癌Hela細(xì)胞p38通路 通過(guò)Western blot檢測(cè) p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平可知：與宮頸癌Hela組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和當(dāng)歸多糖各組Hela細(xì)胞的p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)，且當(dāng)歸多糖各組隨著當(dāng)歸多糖劑量的增加，下調(diào)程度越明顯，這說(shuō)明當(dāng)歸多糖呈劑量依賴(lài)性抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的p38通路。

2.5當(dāng)歸多糖通過(guò)調(diào)節(jié)p38通路抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移 加入p38通路抑制劑SB203580后，通過(guò)Western blot檢測(cè)p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當(dāng)歸多糖高劑量組細(xì)胞p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)，說(shuō)明SB203580和當(dāng)歸多糖都能抑制p38通路下游蛋白p-p38/p38、MMP-2和MMP-9表達(dá)；與當(dāng)歸多糖高劑量組相比，當(dāng)歸多糖高劑量+ SB203580組細(xì)胞p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)。

圖3 各組Hela細(xì)胞遷移和侵襲能力

加入p38通路抑制劑SB203580后，通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況可知：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當(dāng)歸多糖高劑量組細(xì)胞生長(zhǎng)情況明顯被抑制，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)，說(shuō)明SB203580和當(dāng)歸多糖都能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)；與當(dāng)歸多糖高劑量組相比，當(dāng)歸多糖高劑量+SB203580組細(xì)胞生長(zhǎng)情況明顯被抑制，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)，說(shuō)明當(dāng)歸多糖通過(guò)調(diào)節(jié)p38通路抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖4 Western Blot檢測(cè) p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

圖5 加入p38通路抑制劑后，Western Blot檢測(cè)p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

圖6 加入p38通路抑制劑后，通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況

圖7 加入p38通路抑制劑后，各組細(xì)胞遷移和侵襲能力

加入p38通路抑制劑SB203580后，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力發(fā)現(xiàn)：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當(dāng)歸多糖高劑量組細(xì)胞遷移速度明顯被抑制，劃痕閉合率明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖7A)，說(shuō)明SB203580和當(dāng)歸多糖都能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞遷移；與當(dāng)歸多糖高劑量組相比，當(dāng)歸多糖高劑量+ SB203580組細(xì)胞遷移速度明顯被抑制，劃痕閉合率明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖7A)，說(shuō)明當(dāng)歸多糖通過(guò)調(diào)節(jié)p38通路抑制宮頸癌Hela細(xì)胞遷移。

加入p38通路抑制劑SB203580后，通過(guò)Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況發(fā)現(xiàn)：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當(dāng)歸多糖高劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖7B)，說(shuō)明SB203580和當(dāng)歸多糖都能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲；與當(dāng)歸多糖高劑量組相比，當(dāng)歸多糖高劑量+ SB203580組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖7B)，說(shuō)明當(dāng)歸多糖通過(guò)調(diào)節(jié)p38通路抑制宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲。

3 討論

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康和生命的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界宮頸癌死亡約85%是發(fā)生在不發(fā)達(dá)國(guó)家或發(fā)展中國(guó)家，而我國(guó)宮頸癌患者已占到全球病例的 28%以上，同時(shí)每天大約 5 萬(wàn)左右的患者死于該病[9]。而宮頸癌的常規(guī)治療手段雖具有一定效果，但是存在較多副作用和并發(fā)癥。因此，為了更好的治療宮頸癌，急需發(fā)現(xiàn)新藥物。當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸的根，藥性甘、辛、溫，具有活血、補(bǔ)血、潤(rùn)腸、調(diào)經(jīng)、止痛等功效，是臨床最為常用的藥物，素有“十方九歸”之說(shuō)[10]。當(dāng)歸多糖是中藥當(dāng)歸的主要活性成分之一，具有調(diào)經(jīng)、補(bǔ)血、消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、提高機(jī)體免疫及抗腫瘤等藥理作用。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖對(duì)乳腺癌、肝癌、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用[11，12]，因此，當(dāng)歸多糖有望抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。本文通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖呈劑量依賴(lài)性抑制宮頸癌移植瘤的發(fā)展，并抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

局部侵襲和遠(yuǎn)處遷移是臨床治療宮頸癌的主要限制因素，也是導(dǎo)致癌癥患者治療失敗和死亡的主要原因之一。因此，降低宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力可以增強(qiáng)宮頸癌治療效果。本文研究表明當(dāng)歸多糖呈劑量依賴(lài)性抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。p38信號(hào)通路對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲等具有重要的調(diào)節(jié)作用。本文研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖能夠降低p38磷酸化水平，說(shuō)明當(dāng)歸多糖能夠下調(diào)p38通路。已有Li等[13]報(bào)道槐耳水提取物通過(guò)p38途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，Wu等[14]發(fā)現(xiàn)苦參堿通過(guò)下調(diào)p38信號(hào)通路抑制人宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性，因此，下調(diào)p38信號(hào)通路有望抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲。同苦參堿有效抑制Hela細(xì)胞的黏附和侵襲與其通過(guò)抑制p38信號(hào)通路的活性進(jìn)一步調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)一樣[15]，本文發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖在與p38信號(hào)通路抑制劑SB203580聯(lián)合應(yīng)用后，顯著增強(qiáng)了其對(duì)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)的下調(diào)作用及對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲的抑制作用，提示其對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的抑制作用是通過(guò)調(diào)節(jié)p38信號(hào)通路的活性進(jìn)一步調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。且已有研究表明，p38 MAPK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制之一是MMPs的上調(diào)，激活p38信號(hào)通路能夠有效增強(qiáng)下游如MMP-2和MMP-9等多種靶點(diǎn)的表達(dá)與活化[16]。而惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程主要受蛋白水解酶的表達(dá)調(diào)控，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力與蛋白酶的產(chǎn)生程度密切相關(guān)[17]?；|(zhì)金屬蛋白酶是腫瘤細(xì)胞完成轉(zhuǎn)移侵襲的主要蛋白酶，其中以MMP-2 和MMP-9研究最多[18]。MMP-2 和MMP-9的表達(dá)升高后，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)；MMP-2 和MMP-9的表達(dá)受到抑制之后，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯抑制[19]。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖能夠有效抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，這種抑制作用可能是通過(guò)下調(diào)p38信號(hào)通路活性，進(jìn)一步抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這為當(dāng)歸的開(kāi)發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)，為宮頸癌的治療奠定基礎(chǔ)，本文后續(xù)將研究當(dāng)歸多糖對(duì)宮頸癌作用的分子機(jī)制。