熒光定量PCR快速檢測(cè)在病毒性角膜炎診療中的應(yīng)用

秦力維，廖強(qiáng)華，石 芊，彭秀軍，曹利群，高 原，郭建巍，陳昌國(guó)，陳秋圓，馬志家

角膜病變是眼科第三大致盲性疾病，其中病毒性角膜炎是臨床常見(jiàn)的一類眼疾[1]。近年來(lái)，隨著廣譜抗生素和皮質(zhì)類固醇激素的廣泛及不合理使用，該病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。由于皰疹病毒可長(zhǎng)期潛伏在宿主體內(nèi)并反復(fù)發(fā)作，角膜病變由淺至深，反復(fù)遷延，嚴(yán)重者可造成角膜白斑，使視力明顯下降甚至失明，加強(qiáng)對(duì)病毒性角膜炎的診療具有重要意義。作者對(duì)臨床診斷為病毒性角膜炎的患者淚液或角膜上皮細(xì)胞，用熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)方法進(jìn)行了檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案，現(xiàn)將結(jié)果分析總結(jié)如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2016年1月—2018年12月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心就診臨床診斷為病毒性角膜炎、未用過(guò)任何抗病毒藥物、征詢患者同意愿意接受病原檢測(cè)的門診及住院患者共90例，其中男性44例(48.9%)，女性46例(51.1%)，性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.8，P=0.17)?；颊吣挲g20～80(46±12)歲。90例患者中首次發(fā)病就診患者38例，反復(fù)多次發(fā)作后就診患者52例。

1.2 臨床檢查及眼部分泌物的采集 用裂隙燈顯微鏡檢查患者的眼瞼、結(jié)膜、角膜、前房、虹膜、晶狀體情況。在未進(jìn)行抗病毒藥物治療前用一次性塑料滴管吸取患者結(jié)膜囊內(nèi)的分泌物約0.5 mL，對(duì)角膜病變比較深的患者用無(wú)菌刀片刮取角膜上皮細(xì)胞于含有0.5 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中送檢。

1.3 病毒性角膜炎的診斷

1.3.1 病史 入組患者，發(fā)病時(shí)間1 d至數(shù)日，發(fā)病次數(shù)有首次也有反復(fù)多次發(fā)作，有感冒、勞累、過(guò)度用眼、外傷等誘因伴隨，部分患者有自滴消炎眼液、眼膏治療病史，但均未使用過(guò)任何抗病毒藥物治療。

1.3.2 癥狀 單眼或雙眼視力下降、畏光、流淚、眼紅、眼痛、異物感、眼瞼浮腫及分泌物增多等。

1.3.3 體征 結(jié)膜囊水樣及粘性分泌物增多，結(jié)膜充血，睫狀充血，角膜水腫，角膜呈各種類型病變：淺層點(diǎn)狀、樹(shù)枝狀、假樹(shù)枝狀、廣泛糜爛性上皮浸潤(rùn)；水腫；上皮下浸潤(rùn)；角膜基質(zhì)灰白色不規(guī)則浸潤(rùn)；上皮及基質(zhì)熒光素染色陽(yáng)性；角膜內(nèi)皮皺褶；角膜后沉積物；角膜云翳或斑翳形成；角膜知覺(jué)減退；耳前淋巴結(jié)腫大等。

1.3.4 輔助檢查 角膜刮片、普通細(xì)菌及真菌培養(yǎng)。

1.4 儀器與試劑 單純皰疹病毒(herpessimplex virus,HSV)1型、HSV2、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus,VZV)、人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)和EB病毒(EB virus,EBV)熒光定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，其中包括Taq聚合酶、PCR反應(yīng)液(反應(yīng)液中含有5種病毒的特異性熒光探針)、dNTP等；FQ-PCR儀為美國(guó)ABI公司7500。判定標(biāo)準(zhǔn)以核酸檢測(cè)水平大于1 000拷貝/mL為陽(yáng)性。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 核酸提取 取100 μL中加入50 μL DNA裂解液，振蕩混勻，100 ℃金屬浴 10 min，13 000 r/min離心5 min，上清液即為DNA模板。

1.5.2 FQ-PCR反應(yīng) 用AXYGEN8聯(lián)排PCR管，依次加入反應(yīng)液40 μL，Taq聚合酶3 μL，核酸模板2 μL，振蕩均勻后瞬時(shí)離心15 s。PCR反應(yīng)條件為93 ℃ 2 min 93 ℃45 s，55 ℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 40個(gè)循環(huán)；收集熒光。

2 結(jié)果

2.1 病毒性角膜炎診斷和病毒核酸檢出情況 共收集臨床診斷為病毒性角膜炎患者90例，其中上皮型49例(54.4%)，基質(zhì)型41例(45.6%)。上皮型患者中，女性26例(53.1%)，男性23例(46.9%)；基質(zhì)型患者中，女性20例(48.7%)，男性21例(51.3%)。

90例病毒性角膜炎患者中有54例檢測(cè)出皰疹病毒核酸，檢出率為60%;首次檢出36例，多次檢出18例，首次發(fā)病和多次發(fā)病患者的病毒核酸檢出率差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.2,P<0.001)。表1。

表1 首次發(fā)病與多次發(fā)病檢出率比較[n(%)]

49例上皮型皰疹性角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率為30.6%，41例基質(zhì)型病毒性角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率為95.1%，上皮型角膜炎和基質(zhì)型角膜炎患者的皰疹病毒核酸檢出率差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.64,P<0.001)。表2。

表2 上皮型角膜炎與基質(zhì)型角膜炎皰疹病毒核酸檢出率的比較[n(%)]

2.2 首次發(fā)作就診患者中皰疹病毒核酸的檢出情況 發(fā)病后首次就診的38名患者中有36人檢測(cè)出皰疹病毒核酸，檢出率為94.7%，檢出前3位的病毒依次為HSV1(23例)、EBV(6例)和HSV2(3例)。

2.3 多次發(fā)作后就診患者中皰疹病毒核酸的檢出情況 多次發(fā)作后就診的52名患者中有18名檢測(cè)出皰疹病毒核酸，檢出率為34.6%，主要的感染病毒為HSV1(13例)和HCMV(3例)。

2.4 不同類型的角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出情況 90名病毒性角膜炎患者中HSV占病毒檢出數(shù)的74.0%，基質(zhì)型角膜炎中HSV1、EBV、HCMV、HSV2 4種病毒檢出率均高于上皮型角膜炎(圖1)。

圖1 不同類型的角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出情況

上皮型角膜炎中病毒檢出率和平均拷貝數(shù)HSV1(11/15，3.6×105)明顯高于HSV2(1/15，1.2×104)、EBV(1/15，6.1×103)、HCMV(1/15，3.2×103)和VZV(1/15，1.9×103)。

基質(zhì)型角膜炎中病毒檢出率和平均拷貝數(shù)HSV1(25/39，5.7×105)明顯高于HSV2(3/39，3.8×104)、EBV(6/39，3.7×103)、HCMV(4/39，2.9×103)和VZV(1/39，1.7×103)。

3 討論

病毒性角膜炎可發(fā)生于任何年齡，多為單眼發(fā)病。診斷主要依據(jù)為反復(fù)發(fā)作的病史和眼部的臨床表現(xiàn),由于技術(shù)和條件的限制，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室無(wú)法為臨床提供精準(zhǔn)的病原學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在可以用FQ-PCR快速檢測(cè)病毒性角膜炎患者眼部淚液及病變區(qū)角膜上皮細(xì)胞中5種病毒核酸，該方法特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便，臨床醫(yī)生在檢測(cè)2 h后即可獲得檢測(cè)結(jié)果，避免了患者的等待時(shí)間，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可定量檢測(cè)出臨床分泌物標(biāo)本中的5種皰疹病毒,檢測(cè)結(jié)果及病毒拷貝數(shù)為第1次的抗病毒治療提供了科學(xué)依據(jù)，醫(yī)生可以根據(jù)病毒類型和病毒拷貝數(shù)調(diào)整藥物劑量，為病毒性角膜炎的早期診斷、精準(zhǔn)治療和治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)檢測(cè)及療效評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

臨床常見(jiàn)的皰疹病毒感染主要有：人單純病毒性角膜炎、皰疹病毒引起的急性濾泡性結(jié)角膜炎、色素膜炎(包括急性視網(wǎng)膜壞死)和視網(wǎng)膜炎等。引起人病毒性角膜炎的皰疹病毒主要包括HSV1、HSV2、VZV、HCMV和EBV 5種。其中單純皰疹病毒性角膜炎發(fā)病率和致盲率均居角膜病首位，發(fā)病率有不斷增高的趨勢(shì)，是我國(guó)主要的致盲性眼病之一，占角膜盲的首位。我們研究結(jié)果顯示，90例病毒性角膜炎中，皰疹病毒核酸的檢出率為60.0%，5種皰疹病毒中HSV占病毒檢出數(shù)的74.0%，研究結(jié)果與文獻(xiàn)相一致[2]。

EBV為人類4型皰疹病毒，在宿主細(xì)胞內(nèi)主要以潛伏和裂解2種形式存在[3]。90.0%以上成年人體內(nèi)EBV抗體陽(yáng)性，可保護(hù)機(jī)體避免再次感染同種病毒[4-5]。在機(jī)體抵抗力下降時(shí)，潛伏在靜息B淋巴細(xì)胞中的EBV重新活化，導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病的發(fā)生。本研究共發(fā)現(xiàn)8例由EBV引起的病毒性角膜炎，在所有患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中都檢測(cè)到了EBV核酸，血漿中均未檢出EBV核酸，可能與EBV的慢性潛伏和機(jī)體抵抗力下降有關(guān)。

HCMV是導(dǎo)致免疫力低下個(gè)體感染的重要病原體。人類感染HCMV后多表現(xiàn)為無(wú)癥狀潛伏感染，HCMV活化狀態(tài)與機(jī)體免疫系統(tǒng)的下降密切相關(guān)[6]。機(jī)體一旦感染HCMV，將長(zhǎng)期或終身攜帶。本研究中共檢測(cè)到4例由HCMV引起的角膜炎，均為哺乳期女性，經(jīng)進(jìn)一步深入研究，在對(duì)應(yīng)患者的乳汁和尿液中也均檢測(cè)到了HCMV，主要是由于哺乳期女性免疫力下降，自身交叉感染所致。所有男性患者樣本中均未檢測(cè)到HCMV。

VZV是一種致神經(jīng)性疾病的人類皰疹病毒，通常在兒童身上引起水痘，水痘病愈后病毒長(zhǎng)期潛伏于腦神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)軸內(nèi)。當(dāng)人體免疫力下降時(shí)，潛伏的VZV被重新激活，經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)纖維軸突下行至所支配的皮膚區(qū)，增殖后引起帶狀皰疹，本研究中共檢測(cè)到2例由VZV引起的病毒性角膜炎，2例患者在發(fā)病3個(gè)月內(nèi)均有帶狀皰疹病史，病毒性角膜炎主要是由于對(duì)帶狀皰疹治療不徹底、機(jī)體免疫力降低，皰疹病毒液感染角膜所致。

基質(zhì)型角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率為95.1%，高于上皮型角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率(30.6%)，并且基質(zhì)型角膜炎中HSV1、EBV、HSV2、HCMV 4種病毒檢出率均高于上皮型角膜炎，說(shuō)明基質(zhì)型角膜炎中因病毒復(fù)制量大，浸潤(rùn)角膜基質(zhì)深層，病原檢出率高，建議在臨床治療中對(duì)基質(zhì)型皰疹病毒角膜炎要加大抗病毒藥物的劑量和使用頻率，并輔助其他藥物治療，必要時(shí)使用左氧氟沙星滴眼液以防治細(xì)菌性角膜炎的發(fā)生。

臨床上治療病毒性角膜炎的方法很多。我們根據(jù)病毒的檢出情況和疾病分型進(jìn)行個(gè)體化的精準(zhǔn)治療。對(duì)上皮型的角膜炎我們先使用阿昔洛韋滴眼液滴雙眼，3/d，配合小牛血去蛋白提取物眼用凝膠，3/d。由于更昔洛韋生物利用度高，半衰期長(zhǎng)達(dá)8 h，進(jìn)入病毒感染細(xì)胞的速度快，在細(xì)胞中存留時(shí)間長(zhǎng)，因此，本研究選用更昔洛韋進(jìn)行基質(zhì)型角膜炎的抗病毒治療。實(shí)踐證明，更昔洛韋眼用凝膠治療基質(zhì)型角膜炎比阿昔洛韋滴眼液療效好，在角膜組織內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)，滲透性高，對(duì)深層組織的角膜炎、角膜潰瘍治療效果要更快更深入，對(duì)病原學(xué)檢測(cè)中病毒拷貝量大侵害角膜組織深的角膜炎一定要足量使用，由于考慮抗病毒藥物本身對(duì)角膜的毒性作用，角膜營(yíng)養(yǎng)保護(hù)類藥物也要同時(shí)使用。同時(shí)對(duì)于潰瘍侵及深基質(zhì)層的患者除給予抗病毒治療外，還給予免疫抑制劑環(huán)孢素和左氧氟沙星滴眼液。環(huán)孢素主要是選擇性地抑制輔助淋巴細(xì)胞，治療病毒性角膜基質(zhì)炎局部應(yīng)用環(huán)孢素比皮質(zhì)類固醇更有效[7]，局部應(yīng)用環(huán)孢素能抑制皰疹性角膜炎的復(fù)發(fā)[8]，使用左氧氟沙星滴眼液也是考慮到患者局部免疫防疫能力低下，防治細(xì)菌性角膜炎。對(duì)嚴(yán)重感染者還需要進(jìn)行阿昔洛韋全身的抗病毒治療。

研究結(jié)果顯示引起病毒性角膜炎的病原體除了常見(jiàn)的HSV1外，HSV2、EBV、HCMV和VZV感染均可以引起病毒性角膜炎。發(fā)病后首次就診的病毒性角膜炎患者中皰疹病毒核酸的檢出率為94.7%，明顯高于多次發(fā)作后就診的患者(檢出率為34.6%)，可能是首次發(fā)病患者感染局部病毒的復(fù)制比多次發(fā)病患者更為活躍。90例病毒性角膜炎患者中有54例檢測(cè)出皰疹病毒核酸，檢出率為60.0%。導(dǎo)致臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷不一致的原因可能與患者感染病毒性角膜炎后就醫(yī)的及時(shí)性、臨床醫(yī)生取樣的精準(zhǔn)性、病程的長(zhǎng)短、病毒的多樣性、病毒復(fù)制所處的時(shí)期和病毒潛伏的狀態(tài)等因素有關(guān)。建議臨床診斷為病毒性角膜炎的患者應(yīng)盡早使用FQ-PCR進(jìn)行5種皰疹病毒核酸的檢測(cè),并在急性期盡快使用抗病毒藥物,以阻止病毒復(fù)制,以免患者抵抗力下降合并細(xì)菌和真菌感染。

特別指出的是，上皮型和基質(zhì)型角膜炎中HSV的檢出率和拷貝數(shù)明顯高于其他病毒檢出率和拷貝數(shù)。對(duì)HSV感染的患者要加大抗病毒藥物的劑量和適當(dāng)延長(zhǎng)治療周期，治療過(guò)程中定期進(jìn)行病毒核酸檢測(cè),以指導(dǎo)臨床用藥，連續(xù)3次檢測(cè)陰性可停用抗病毒藥物。

研究結(jié)果還提示，病毒性角膜炎的發(fā)生與皰疹病毒的全身感染密切相關(guān)，有些患者并無(wú)全身感染的跡象，但在外周血單個(gè)核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了潛伏的病毒，這對(duì)感染者皰疹病毒相關(guān)疾病的防控提出了新的要求，值得相關(guān)學(xué)科醫(yī)生的關(guān)注，也值得進(jìn)一步深入研究。