基于matK序列將中藥石斛鑒定到屬

黃周英 桑慶亮 陳懷宇

摘 要：以蘭科的石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬等14屬matK全長CDS為研究對象，通過比較屬內(nèi)、屬間序列兩兩p-距離，得到屬內(nèi)p-距離上限和屬間p-距離下限，并以石斛屬、石豆蘭屬和石仙桃屬3個近緣屬的matK部分CDS為待檢序列進(jìn)行實地鑒定.結(jié)果表明，基于matK可清楚地將石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬序列鑒定到其對映的屬，表明基于matK序列可將中藥石斛鑒定到屬.

關(guān)鍵詞：中藥石斛;matK;鑒定

中圖分類號：S567.239? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）01-0052-04

石斛屬在分類學(xué)上屬于蘭科樹蘭族石斛亞族，我國共有74種2變種[1].我國石斛屬植物主要分布在秦嶺——淮河以南各省區(qū)，其中以云南省石斛種類為最多[2].2015年版《中華人民共和國藥典》[3]收載的中藥石斛為金釵石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛的栽培品及其同屬植物近似種新鮮或干燥莖，其干燥品具益胃生津，滋陰清熱的功效，同時提及“及其同屬植物近似種”，即表示原植物仍未明確之意.

實際上，各地栽培和開發(fā)的中藥石斛多達(dá)近40種[4，5]，但究竟哪種石斛屬物種為中藥石斛的正源尚無定論[6，7];中藥石斛中?；煊薪鹗鷮?、石仙桃屬、石豆蘭屬某些物種[4]，這給中藥石斛在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用帶來了很大的問題，因此，建立一套行之有效的鑒定方法是解決這些問題的重要一環(huán).

matK基因是位于葉綠體trnK基因第1號內(nèi)含子中的成熟酶基因，參與II類內(nèi)含子的剪接，是已知進(jìn)化速度最快的葉綠體編碼基因，一般認(rèn)為matK可以作為單獨使用的植物條形碼[8，9]，且因此得到CBOL的Plant Working Group推薦作為植物的條形碼[10].事實上，單獨使用matK仍無法完全解決問題，尤其是對于復(fù)雜的類群需有針對性地將matK與rbcL組合才可達(dá)到目的[10]，也就是說，仍沒有一種可以通用的植物條形碼序列.

研究表明，matK能識別90%的蘭科植物[11]，在將matK應(yīng)用于石斛屬鑒定的實踐中，劉靜等[12]、騰艷芬等[13]、Srikulnath等[14]、鐘志敏[15]的研究均認(rèn)為matK至少在不同程度上可以用于石斛屬物種的分子鑒定，而黃海等[16]、Xu等[17]認(rèn)為matK序列并不適于作為石斛屬DNA條形碼鑒定.為此，十分有必要對matK在石斛屬，乃至蘭科植物鑒定中的作用進(jìn)行全面的評估，為建立完整的石斛屬植物鑒定方法提供依據(jù).

本文以葉綠體基因matK全長CDS為依據(jù)，比較分析了石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬等14個屬的屬內(nèi)、屬間p-距離差異，并選取石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬matK部分CDS進(jìn)行鑒定，以依據(jù)matK序列將物種鑒定到屬.

1 材料與方法

1.1 材料

從GenBank數(shù)據(jù)庫提取石斛屬、石豆蘭屬、石仙桃屬、貝母蘭屬、蝦脊蘭屬、斑葉蘭屬、蘭屬、開唇蘭屬共8個蘭科屬，與水稻屬、玉蜀黍?qū)佟⑿←湆?、甘蔗屬共個禾本科屬以及蕓苔屬、鼠耳芥屬共2個十字花科屬的matK全長CDS及石仙桃屬、開唇蘭屬、石豆蘭屬長度大于1100bp的matK序列（表1）.

1.2 方法

1.2.1 序列獲取

使用Biopython[18]的Entrez模塊調(diào)用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)檢索并獲取所需matK序列，對數(shù)據(jù)文件解析后提取其序列及相關(guān)信息.

1.2.2 序列比對、p-距離計算及繪圖

采用muscle[19]進(jìn)行多序列比對，采用megacc[20]計算p-距離（p-distance）[21]，提取p-距離數(shù)據(jù)后使用python環(huán)境下的matplotlib模塊和seaborn模塊繪圖.

1.2.3 統(tǒng)計檢驗

數(shù)據(jù)組間的差異采用Wilcoxon檢驗[22]，在Python環(huán)境下使用scipy.stats模塊實現(xiàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 屬內(nèi)、屬間p-距離比較

2.1.1 各屬屬內(nèi)p-距離比較

將供試14個屬matK序列屬內(nèi)p-距離繪成箱形圖（圖1），結(jié)果表明，不同屬matK序列屬內(nèi)p-距離變化范圍差異較大，大部分小于0.04，個別屬內(nèi)差異較大，如開唇蘭屬（屬內(nèi)p-距離可達(dá)0.08）.因此，屬內(nèi)p-距離上限需根據(jù)各屬的具體情況而定，對于石斛屬來說，該值可定為0.02，而對于開唇蘭屬來說，則可定為0.04，即當(dāng)某未知序列與石斛屬matK序列的p-距離小于0.02，即可認(rèn)為該序列來自石斛屬物種.

2.1.2 石斛屬與各屬間兩兩p-距離比較

將石斛屬matK序列分別與供試14個屬的matK序列進(jìn)行屬間兩兩序列p-距離計算，結(jié)果繪成箱形圖（圖2），可以看出，按照與石斛屬間p-距離由小到大排列為石斛屬（屬內(nèi)）、蝦脊蘭屬、貝母蘭屬、石仙桃屬、石豆蘭屬、蘭屬、斑葉蘭屬、開唇蘭屬、小麥屬、水稻屬、玉蜀黍?qū)佟⒏收釋?、蕓苔屬和鼠耳芥屬.石斛屬與同科其他屬間p-距離數(shù)值均小于0.1，而與禾本科4個屬之間的屬間p-距離為0.2～0.25之間，表明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，matK序列差異越大.

但石斛屬matK序列與同科的蝦脊蘭屬、貝母蘭屬、石仙桃屬和石豆蘭屬差異較小，p-距離數(shù)值小于0.05且與石斛屬內(nèi)p-距離相比差異不顯著（P>0.05），因此難以準(zhǔn)確鑒別;開唇蘭屬、斑葉蘭屬及蘭屬與石斛屬間的p-距離則與石斛屬內(nèi)p-距離相比有顯著差異（P<0）.蘭科與禾本科之間0.1-0.2之間為科之間的gap區(qū)，說明matK序列可用于區(qū)分不同科.

2.1.3 近緣屬兩兩之間p-距離的比較

為進(jìn)一步弄清這些近緣屬間是否可基于matK這一單一序列可區(qū)分，將石斛屬與其他各屬進(jìn)行兩兩作圖（圖3），可以明顯看出，石斛屬與貝母蘭屬、石仙桃屬、石豆蘭屬、蝦脊蘭屬、開唇蘭屬、斑葉蘭屬、蘭屬及不同科的鼠耳芥屬均可以借助matK序列明確可分（P<0.01），屬內(nèi)與屬間p-距離的交疊區(qū)很小.因此，可基于matK序列鑒定到屬.

其中，A-H分別為石斛屬與蝦脊蘭、貝母蘭屬、蘭屬、石仙桃屬、石豆蘭屬、斑葉蘭屬、開唇蘭屬及鼠耳芥屬兩兩之間屬內(nèi)、屬間的p-距離比較;Wilcoxon檢驗結(jié)果標(biāo)記在兩屬箱圖上方，“*”代表顯著差異（p<0.05），“**”代表極顯著差異（p<0.01）.

2.2 matK序列歸屬鑒定

以石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬的matK序列序列作為待檢序列，分別與上述14個屬兩兩組合，比對并計算兩兩屬間p-距離，依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判斷等檢序列的歸屬：

（1）在所分析屬中值最小;（2）低于該屬內(nèi)上限.

2.2.1 石斛屬matK部分CDS的鑒定結(jié)果

將獲取的石斛屬matK序列作為待檢序列分別與各屬matK全長CDS組合后比對并計算p-距離，石斛屬待檢序列與其余各屬間的p-距離分布情況見圖4，很明顯蘭科以外的屬與待檢序列的p-距離為0.2～0.3，遠(yuǎn)高于屬內(nèi)p-距離上限，同為蘭科的屬中，蘭屬、蝦脊蘭屬、開唇蘭屬和斑葉蘭屬與待檢序列的p-距離為0.1上下，與石斛屬之間比較有顯著差異（P<0.01）.因此，待檢序列不能鑒定為來自這10個屬的物種.

余下的4個屬均為蘭科石斛屬的近緣屬，即石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬、貝母蘭屬，與待檢序列間p-距離無顯著差異（P值均大于0.05），因此，通過Wilcoxon檢驗不能找出唯一的結(jié)果.但是，比較后發(fā)現(xiàn)，待檢序列與石斛屬間的p-距離最小，石仙桃屬次之，然后是貝母蘭屬和石豆蘭屬，可據(jù)此將待檢序列定為石斛屬.

A-H分別為石斛屬matK待檢序列與石仙桃屬、石斛屬、石豆蘭屬、開唇蘭屬、蘭屬、貝母蘭屬、斑葉蘭屬及蝦脊蘭屬兩兩屬間p-距離比較結(jié)果.

2.2.2 石仙桃屬鑒定結(jié)果

以石仙桃屬matK部分CDS作為待檢序列，分別與各屬matK全長CDS兩兩組合，比對并計算p-距離并繪制箱形圖，由圖6可見，非蘭科的屬可很容易地排除在外，同屬蘭科的斑葉蘭屬和開唇蘭屬也有明顯gap，石斛屬、石豆蘭屬、蘭屬和蝦脊蘭屬應(yīng)也有顯著差異（P<0.01），石仙桃屬和貝母蘭屬則明顯差異較小，且有明顯交疊區(qū)（圖7F），難以區(qū)分（P>0.05）.

A-H分別為石仙桃屬matK待檢序列與石仙桃屬、石斛屬、石豆蘭屬、開唇蘭屬、蘭屬、貝母蘭屬、斑葉蘭屬及蝦脊蘭屬兩兩屬間p-距離比較結(jié)果.

2.2.3 石豆蘭屬鑒定結(jié)果

以石豆蘭屬matK部分CDS作為待檢序列，分別與各屬matK全長CDS兩兩組合，比對并計算p-距離并繪制箱形圖，由圖8可知，禾本科和十字花科的屬與蘭科各屬間具很大的gap，同屬蘭科的斑葉蘭屬、蝦脊蘭屬和開唇蘭屬與待檢序列間的p-距離顯著高于石豆蘭屬（P<0.05），石斛屬、石豆蘭屬、石仙桃屬及貝母蘭屬互有疊區(qū)（圖9A、B、C），難以區(qū)分（P值均大于0.05）.

A-H分別為石豆蘭屬matK待檢序列與石仙桃屬、石斛屬、石豆蘭屬、開唇蘭屬、蘭屬、貝母蘭屬、斑葉蘭屬及蝦脊蘭屬兩兩屬間p-距離比較結(jié)果.

3 討論

3.1 matK序列可將植物鑒定至屬

本研究通過對來自蘭科、禾本科、十字花科的14個屬的比較分析，明確了屬內(nèi)p-距離上限為0.1，屬間p-距離下限為0.3.以此gap為基礎(chǔ)，建立將matK序列鑒定到屬的方法，即將待檢序列與目標(biāo)屬的所有matK全長CDS進(jìn)行兩兩p-距離計算，從中選擇p-距離小于0.1且排在各屬最末尾（中位數(shù)最?。┑膶俣樵搈atK序列的物種來源.

然后，以鑒定的屬分別對其余各屬進(jìn)行組間Wilcoxon檢驗，以確定鑒定結(jié)果在95%或99%的置信區(qū)間內(nèi)可信，若P>0.05，則可能有多種可能，即結(jié)果不唯一.

采用該方法，將石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬物種的待檢序列（石仙桃屬、石豆蘭屬與之前建立方法所有序列有部分重疊，其余均不同，且待檢對象均為matK序列序列）.待檢序列均可成功鑒定至所在屬.

3.2 中藥石斛鑒定到屬的意義

據(jù)考證[6，23-25]，中藥石斛中?；煊衼硖幗墝?，如石豆蘭屬、石仙桃屬、金石斛屬等的物種，而且即使來自石斛屬的植物，也有多達(dá)40種左右被認(rèn)作中藥石斛的原植物[4]，且栽培中經(jīng)常是多種混種混收[15]，因此混用石斛屬植物作為中藥石斛成為目前的常態(tài).相比于同屬的近緣種，確定待檢樣品是否屬于石斛屬對中藥石斛道地性的鑒別的第一步，因此，我們認(rèn)為應(yīng)首先將中藥石斛鑒定到屬.

為此，采用matK通過計算比較p-距離的方式，更為精細(xì)的鑒別，如種及種以下分類階的鑒別，有賴于對中藥石斛原植物的明確的結(jié)論，以及較為細(xì)致的序列分析和更為有效的分子序列片段的發(fā)掘.

3.3 影響分子鑒定的因素

首先，傳統(tǒng)分類中仍然存在很多問題，對很多物種的歸屬仍存在爭議，且中藥石斛原植物不明確，這使得分子鑒定缺乏可靠的參照;其次，中藥石斛干品難以獲取理想的DNA模板，造成序列擴(kuò)增困難;第三，序列數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)量多少不一、質(zhì)量參差不齊，造成分子鑒定難以獲得理想的結(jié)果;最后，問題序列的存在有可能造成錯誤的結(jié)論.

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