納米硒的制備及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

蘇華華，王艷華

三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002

硒最早于1817年由瑞典化學(xué)家Berzelius從硫酸廠的鉛室底部的紅粉色物質(zhì)中制得，并把它命名為硒[1]。硒是生物體不可缺少的微量元素。硒的營養(yǎng)功能是通過25個含有硒代半胱氨酸活動中心的硒蛋白來實現(xiàn)的。流行病學(xué)、生物學(xué)和臨床研究表明，硒缺乏會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，例如甲狀腺功能障礙、糖尿病、心血管疾病、認(rèn)知功能低下和癌癥[2]。膳食補(bǔ)充中最常用的硒形式是有機(jī)硒（硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸）和無機(jī)硒（硒酸鹽、亞硒酸鹽），但它們在功能性和毒性之間非常窄的濃度閾值限制了其在臨床疾病防治中的廣泛應(yīng)用[3-4]。因此，毒性檢測一直是開發(fā)硒基抗癌藥物的關(guān)鍵問題[5]。許多研究表明，與有機(jī)或無機(jī)硒化合物相比，納米硒的毒性更小，生物利用度更高，具有更強(qiáng)的生物活性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。納米硒可以通過物理法、化學(xué)法和生物法合成。本文將對納米硒的制備以及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

1 納米硒的制備

1.1 物理合成法

納米硒可以通過輻射法和激光燒蝕法進(jìn)行合成。El-Batal等[8]采用γ線輻照輔助的方法獲得納米硒。Guisbiers等[9]通過脈沖激光燒蝕浸沒在去離子水中的純硒丸，得到粒徑為115±38 nm的納米硒顆粒，納米硒的大小可以通過激光參數(shù)（如波長和脈沖持續(xù)時間）等來控制且不易受到化學(xué)試劑的污染。但物理法一般需要高溫、高壓、催化劑等技術(shù)，低效率、低產(chǎn)量和昂貴的儀器設(shè)備使其并未廣泛用于納米硒的生產(chǎn)中。

1.2 化學(xué)合成法

化學(xué)方法制備納米硒通常是用抗壞血酸還原亞硒酸鈉溶液，但此方法獲得的納米硒顆粒易團(tuán)聚，因此，加入分散劑或穩(wěn)定劑來使納米硒維持穩(wěn)定為制備納米硒材料提供了極好的途徑。Xiao等[10]使用冬蟲夏草胞外多糖（EPS）作為穩(wěn)定劑，在亞硒酸鈉和抗壞血酸的氧化還原體系中合成了單分散的納米硒（EPS-SeNPs），EPS-SeNPs表面多糖羥基的物理吸附作用增強(qiáng)了納米硒的穩(wěn)定性。Xia等[11]首次以甲醛次硫酸氫鈉（SFS）為還原劑，在50℃下連續(xù)攪拌4 h制備得高純度三角硒（t-Se）納米線，其粒徑為100～200 nm，長度則可達(dá)10 μm。Zhang等[12]以β乳球蛋白（Blg）作為穩(wěn)定劑制備了粒徑為36.8±4.1 nm的球形納米硒（Blg-SeNPs）。傅里葉紅外光譜（FTIR）檢測結(jié)果表明，β乳球蛋白分子上的功能性基團(tuán)（即-NH2和-OH）和疏水域可以與納米硒結(jié)合形成穩(wěn)定的納米系統(tǒng)。Blg-SeNPs在4℃的酸性或中性至堿性溶液（pH2.5～3.5或6.5～8.5）中穩(wěn)定長達(dá)30 d。

1.3 生物合成法

利用植物提取物、真菌、細(xì)菌合成生物源性納米硒顆粒已被廣泛報道。植物和微生物中的生物分子在納米顆粒合成過程中發(fā)揮著還原和穩(wěn)定的雙重作用。Fesharaki等[13]將含納米硒顆粒的肺炎克雷伯菌培養(yǎng)液于121℃滅菌20 min，釋放出粒徑為245 nm的納米硒粒子。在濕熱滅菌過程中，納米硒粒子沒有發(fā)生化學(xué)變化，說明微生物合成的納米硒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以耐高溫、高壓。Xu[14]等報道了干酪乳桿菌ATCC393在厭氧條件下將有毒的亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為紅色元素硒來產(chǎn)生納米硒，以粒徑50～80 nm在細(xì)胞內(nèi)積累。此外，與亞硒酸鈉和硒代蛋氨酸相比，被生物蛋白-多糖封端的納米硒具有更低的細(xì)胞毒性。Vetchinkina等[15]首次采用藥用擔(dān)子菌香菇菌株F-249還原有機(jī)硒和無機(jī)硒化合物來制備生物納米硒。通過透射電子顯微鏡（TEM），電子能量損失譜（EELS）和X線熒光顯示，被還原的硒以粒徑為180.51±16.82 nm的球形納米顆粒的形式在菌絲細(xì)胞內(nèi)積累。Ahmad等[16]用酵母提取物轉(zhuǎn)化硒的有毒氧陰離子，在細(xì)胞內(nèi)合成粒徑為50～250 nm的球形納米硒顆粒。Chen等[17]研究發(fā)現(xiàn)，從海藻裙帶菜中提取的多糖可以增強(qiáng)納米硒的穩(wěn)定性，所形成的單分散球形納米硒在多糖溶液中可以保持穩(wěn)定至3個月。Mellinas等[18]以可可豆殼提取物作為穩(wěn)定劑和還原劑，通過微波加熱成功合成了粒徑為1～3 nm的納米硒，所獲得的納米硒在4℃下可穩(wěn)定55 d。

2 納米硒在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1 抗氧化作用

納米硒比其他化學(xué)形式的硒具有更好的抗氧化能力，是一種高效的抗氧化劑，可通過清除自由基、激活抗氧化硒酶的活性、增強(qiáng)抗氧化防御體系等多種方式發(fā)揮抗氧化作用。Xiao等[10]研究發(fā)現(xiàn)合成的生物納米硒具有很強(qiáng)的抗氧化活性，對2，2-聯(lián)氮-二-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽自由基陽離子（ABTS+）和超氧陰離子自由基具有明顯的清除能力，并且在Se/P比例為1∶1時合成最小尺寸為80 nm，清除自由基的能力最強(qiáng)。Chen等[19]使用殼聚糖（CS）作為還原劑和穩(wěn)定劑合成了83～208 nm的CS-Se納米復(fù)合材料。研究發(fā)現(xiàn)，CS-Se納米復(fù)合材料能直接清除1，1-二苯基-2-三硝基苯自由基（DPPH）、ABTS+自由基和羥基自由基；此外，納米粒子的大小對自由基的清除活性有著顯著影響，在體外不同尺寸大小的CS-Se納米復(fù)合材料清除自由基的能力隨尺寸的增加而減小，揭示納米硒顆粒的大小在其生物學(xué)活性中起重要作用。Gunti等[20]報道合成的生物納米硒表現(xiàn)出劑量依賴性的自由基清除活性，并且與亞硒酸鈉相比，生物納米硒對小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞具有更好的生物相容性和低毒性。Bai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠口服負(fù)載納米硒顆粒的殼聚糖微球，可以減少脂質(zhì)過氧化并增強(qiáng)小鼠血清和肝臟中的谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性來抑制酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。Guo等[22]合成牛血清白蛋白（BSA）穩(wěn)定的納米硒，通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝，增加抗氧化硒酶或硒蛋白的表達(dá)，顯著減輕小鼠的高脂血癥和血管損傷，在預(yù)防動脈粥樣硬化中具有潛在的價值。

2.2 抗菌和抗病毒作用

近年來，納米硒在抗菌方面的應(yīng)用被廣泛研究。納米硒作為廣譜抗菌劑具有巨大潛力，對病原細(xì)菌、真菌和寄生蟲具有重要的抗菌活性。醫(yī)療器械上的微生物定植和生物膜的形成是引起醫(yī)院感染的普遍問題。這不僅影響危重病人和免疫功能受損的患者，同時也會導(dǎo)致設(shè)備的故障。Sonkusre等[23]報道，利用地衣芽孢桿菌合成的生物納米硒能抑制金黃色葡萄球菌在不同表面（聚苯乙烯、玻璃和導(dǎo)管）的黏附、生物膜和微菌落的形成。這些研究結(jié)果對于作為抗金黃色葡萄球菌假體的抗菌涂層和其他院內(nèi)感染的醫(yī)療器械具有潛在應(yīng)用價值。Guisbiers等[24]報道納米硒顆粒很容易黏附在生物膜上，然后滲透到病原體中被硫取代，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，從而抑制白色念珠菌生物膜的形成。Joshi等[25]研究發(fā)現(xiàn)合成的生物納米硒對稻瘟病菌表現(xiàn)出優(yōu)異的體外抗真菌活性，分別以50和100 ppm的濃度抑制辣椒和番茄葉片上的辣椒炭疽菌和鏈格孢菌的感染，并具有聚集和結(jié)合致病假單胞菌的游動孢子的獨特性質(zhì)。這揭示了納米硒針對不同植物病原體的廣譜抗真菌活性，從而以一種生態(tài)友好的方式管理植物病。Yazhiniprabha等[26]研究了用調(diào)料九里香（Murraya koenigii，Mk）提取物合成的球形納米硒（Mk-SeNps）的抑菌和殺幼蟲功效。結(jié)果顯示，Mk-SeNPs對引起登革熱的埃及伊蚊的第4齡幼蟲具有顯著的殺幼蟲活性，并且可有效抑制革蘭陽性菌（變形鏈球菌和糞腸球菌）和革蘭陰性菌（銅綠假單胞菌和痢疾志賀菌）的生長。

納米硒還顯示出良好的抗病毒作用。Li等[27]合成了奧司他韋（OTV）表面修飾的納米硒（Se@OTV），具有良好的抗病毒性和耐藥性。雖然OTV本身作為一種有效的抗病毒藥物在臨床上的應(yīng)用通常受到耐藥病毒的限制，但Se@OTV對H1N1流感病毒有明顯的抑制作用。Se@OTV通過抑制流感病毒糖蛋白血凝素和神經(jīng)氨酸酶的活性來干擾H1N1感染宿主細(xì)胞。被修飾的納米硒能夠阻止H1N1感染犬腎細(xì)胞，阻斷染色質(zhì)凝聚和DNA斷裂。此外，Se@OTV還抑制了活性氧的產(chǎn)生以及p53磷酸化和Akt的激活。因此，ROS在抗病毒作用中起關(guān)鍵作用。H1N1病毒的存在使細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生從100%（對照）增加到380%，OTV和SeNPs略微抑制了ROS的產(chǎn)生，分別為270%和210%，而Se@OTV顯著降低了ROS的產(chǎn)生（120%）。由此可見，Se@OTV可作為一種高效抗病毒藥物，用于治療由甲型流感病毒H1N1引起的高度傳染性呼吸道疾病。

2.3 抗癌作用

納米硒因具有高生物利用度、低細(xì)胞毒性、強(qiáng)抗癌活性等特點，近年來成為一種很有前途的抗癌藥物。而其中誘導(dǎo)和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡是它發(fā)揮抗癌作用的重要分子生物學(xué)機(jī)制。Cui等[28]將阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）修飾在納米硒表面合成FA-SeNPs，在人肝癌HepG2細(xì)胞中具有明顯的抗增殖作用。FA-SeNPs以劑量依賴性方式增加上游caspase-9和下游caspase-3的蛋白質(zhì)水平，通過線粒體途徑誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡。Zeng等[29]制備了蘑菇多糖修飾的具有高穩(wěn)定性的球形納米硒顆粒，通過誘導(dǎo)胱天蛋白酶和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑在體內(nèi)起抗腫瘤作用，但對正常器官沒有明顯毒性。Gao等[30]在體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)，豬苓多糖（PUP）穩(wěn)定的納米硒（PUP-SeNPs）對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞毒性和抗增殖活性，并通過內(nèi)在和外在途徑參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PUP-SENPSe可以裂解聚ADP核糖聚合酶（PARP），激活caspase-9、caspase-8和caspase-3，并通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。因此，PUP-SeNP可作為膳食補(bǔ)充劑用于乳腺癌的化學(xué)預(yù)防。

2.4 藥物載體

化學(xué)療法是一種常用的癌癥治療策略，但會破壞正常組織而引起嚴(yán)重的副作用[31]。因此，近年來，靶向藥物遞送系統(tǒng)在癌癥治療中受到極大的關(guān)注。利用其功能的多樣性和受體結(jié)合的特異性，多種含硒納米載體（如加載基因、抗體、藥物、生長因子等）被設(shè)計并合成，使其在抗癌治療中顯示出巨大潛力。功能化的納米硒作為靶向藥物遞送系統(tǒng)可以增強(qiáng)細(xì)胞攝取和抗癌功效，在癌癥治療中具有重要作用。Zou等[32]使用透明質(zhì)酸（HA）修飾的納米硒裝載紫杉醇（PTX）制備了HA-Se@PTX。HA-Se@PTX能夠通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被癌細(xì)胞攝取，并通過激活caspase-3凋亡相關(guān)的信號通路來誘導(dǎo)凋亡，而不會對腫瘤小鼠的主要器官造成嚴(yán)重?fù)p傷，在非小細(xì)胞肺癌治療中具有巨大潛力。Yang等[33]研究了葉 酸（folic acid，F(xiàn)A）修 飾 的 納 米 硒 顆 粒（FA@SeNPs）協(xié)同增強(qiáng)放射性125I粒子的抗癌功效。研究表明，與X線相比，125I粒子表現(xiàn)出與FA@SeNPs具有更高的協(xié)同作用，通過活性氧的過量產(chǎn)生誘導(dǎo)DNA損傷并激活p53和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）凋亡信號通路，觸發(fā)MCF-7癌細(xì)胞凋亡和G2/M細(xì)胞周期阻滯。這種聯(lián)合治療可改善抗癌藥物的細(xì)胞靶向性并表現(xiàn)出放射增敏活性，顯示了更好的體內(nèi)抗腫瘤活性和更低的全身毒性，可用于癌癥治療。Fu等[34]報道了精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）肽修飾的、負(fù)載阿霉素（DOX）的納米硒（RGD-NPs）。研究表明，與裸露的納米硒和DOX相比，RGD-NPs通過整合素受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），然后在溶酶體中積累，以時間和劑量依賴的方式抑制HUVEC的增殖。功能化的納米硒在酸性刺激下膨脹成雪花狀結(jié)構(gòu)，可以延長藥物的釋放時間。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，RGD-NPS通過誘導(dǎo)活性氧介導(dǎo)的DNA損傷，抑制VEGFVEGFR2-ERK/AKT信號通路，使HUVEC凋亡和S期細(xì)胞周期阻滯，從而抑制裸鼠腫瘤生長和血管生成。為了探索納米硒傳遞基因的可行性，Xia等[35]制備了以納米硒作為腫瘤靶向基因載體，負(fù)載小干擾RNA（siRNA）的功能化的納米硒用于人宮頸癌的治療。功能化的納米硒具有更高的體內(nèi)抗腫瘤活性，在癌細(xì)胞微環(huán)境中顯示出更快的siRNA釋放，通過活性氧介導(dǎo)的線粒體功能障礙誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)語

綜上所述，納米硒在生物醫(yī)學(xué)方面具有較大的應(yīng)用潛力。隨著制備工藝的進(jìn)步，利用生物合成納米硒，不僅可提高它的分散性能，而且還可增強(qiáng)其生物活性（抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌等），是當(dāng)前合成納米硒顆粒的最佳選擇。材料-細(xì)胞相互作用也提示，生物合成的納米硒顆粒對正常細(xì)胞低毒而對腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷，這些特征有益于未來將其作為抗癌治療劑使用。然而當(dāng)前的研究僅僅呈現(xiàn)了它們的生物作用，對其生物作用的機(jī)理，尤其是抗癌作用的分子機(jī)制尚知之甚少。且在人體復(fù)雜的生理病理環(huán)境中，這些納米硒是否具有毒性，是否能參與激活免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞，又是如何發(fā)揮作用的，這些問題仍有待于繼續(xù)深入研究。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和研究工作的不斷深入，納米硒材料在抗菌、抗氧化、抗癌、藥物載體等領(lǐng)域?qū)⑷〉迷絹碓綇V闊的應(yīng)用。