低體溫膿毒癥小鼠模型建立及體溫變化在急性感染中的意義

李艷萍，黃坤，呂宇飛，黃競(jìng)，于久飛

1.民航總醫(yī)院（北京大學(xué)民航臨床醫(yī)學(xué)院）消化腫瘤科，北京 100123；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

膿毒癥是臨床常見癥狀，主要是由感染引起的機(jī)體反應(yīng)失調(diào)，最終導(dǎo)致器官功能障礙，常發(fā)展為膿毒癥休克，病情兇險(xiǎn)，即使經(jīng)醫(yī)療干預(yù)，死亡率依然高達(dá)35%～40%[1]。任何部位感染均可引發(fā)膿毒癥，臨床上常見于腹膜炎、膽管炎、肺炎以及泌尿系統(tǒng)感染等。其中消化系統(tǒng)中多種原因可致病，如消化道急性穿孔或穿孔后保守治療、急性化膿性梗阻性膽管炎、急性胰腺炎，并常常導(dǎo)致膿毒性休克。此外，肝硬化患者由于免疫力低下，很容易發(fā)生細(xì)菌感染、膿毒癥和膿毒癥所致器官功能衰竭，死亡率可高達(dá)65%[2-3]。

膿毒癥致病機(jī)理目前被認(rèn)為是一種復(fù)雜的炎癥調(diào)節(jié)失調(diào)，當(dāng)宿主不能成功地控制感染時(shí)，這種炎癥調(diào)節(jié)失調(diào)最終通過影響內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等影響多個(gè)器官，從而導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的機(jī)體損害[4-7]。膿毒癥炎癥反應(yīng)可涉及2個(gè)不同但并非相互排斥的階段，即全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）和代償性抗炎反應(yīng)綜合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS），而二者的平衡，以及這些炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，極大地影響宿主的存活[8-9]。

發(fā)熱和體溫過低都是膿毒癥的特征[10]，雖然發(fā)熱對(duì)機(jī)體有一定的損傷，但可幫助機(jī)體清除入侵病原體[11-12]。然而，一些嚴(yán)重感染的患者在入院時(shí)常出現(xiàn)體溫過低（＜36℃）。研究發(fā)現(xiàn)體溫過低是死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]，因此，臨床上膿毒癥患者體溫過低較發(fā)熱更加兇險(xiǎn)。一些觀察性研究和隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的數(shù)據(jù)也表明，10%～20%的膿毒癥患者出現(xiàn)低溫，死亡率約為發(fā)熱患者的2倍[12-14]。對(duì)于低體溫的原因有多種觀點(diǎn)，一些研究認(rèn)為是由于體內(nèi)抑炎因子如IL-10、IL-4等過多表達(dá)引起，還有部分研究認(rèn)為感染可導(dǎo)致中樞體溫調(diào)節(jié)紊亂。然而，膿毒癥期間體溫過低的機(jī)制依然不清楚。為了對(duì)低溫膿毒癥進(jìn)行研究，須建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型。由于膿毒癥腹部感染率高達(dá)72.3%，為最常見的感染部位，同時(shí)在國(guó)內(nèi)膿毒癥主要以革蘭陰性菌感染為主[15-16]，因此，我們用常見的腸道致病菌福氏志賀菌，通過腹部感染小鼠，建立了低溫膿毒癥模型，并在感染后進(jìn)行不同干預(yù)，研究感染強(qiáng)度與體溫變化的關(guān)系，為膿毒癥導(dǎo)致體溫過低的機(jī)制研究提供了思路和方向，也為體溫作為簡(jiǎn)單便捷的監(jiān)測(cè)指標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，16～18 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]；福氏志賀菌301株保存于軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所；福氏志賀菌多糖結(jié)合疫苗由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所制備；胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒和HE染色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；卡那霉素購(gòu)自Sigma公司。

1.2 膿毒癥模型的建立

將福氏志賀菌培養(yǎng)用液體LB培養(yǎng)基于37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，之后按照體積比1∶100轉(zhuǎn)接于新的LB培養(yǎng)基中并培養(yǎng)至菌液D600nm值達(dá)到2.0。取100 μL菌液經(jīng)系列梯度稀釋后涂板計(jì)數(shù)，計(jì)算D600nm值為2.0時(shí)每100 μL菌液的菌落形成單位（CFU），之后按照計(jì)數(shù)濃度，在D600nm至2.0時(shí)按照所需劑量以及每只小鼠200 μL的體積，將原菌液稀釋至不同濃度。將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，按照不同菌液濃度進(jìn)行小鼠腹腔注射。

1.3 小鼠體溫測(cè)定

以小鼠腸溫作為小鼠體溫。抓取小鼠后腹部朝上，打開小鼠專用體溫計(jì)并將檢測(cè)探頭前端蘸取少量甘油，將探頭輕輕緩慢插入小鼠肛門約5 cm，靜置5～10 s，待溫度穩(wěn)定后讀取體溫?cái)?shù)值。

1.4 感染后細(xì)胞因子檢測(cè)

BALB/c小鼠20只，隨機(jī)分為正常組和感染組，每組10只，其中感染組按照2×107CFU/只的劑量進(jìn)行腹腔感染，并于感染后8 h取眼球血，血樣于37℃孵育1 h后4℃過夜，離心收集血清，采用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)血清中各細(xì)胞因子濃度。首先將預(yù)包被不同細(xì)胞因子的板子用洗液洗3次，分別加入100 μL稀釋的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，各樣本設(shè)置復(fù)孔，37℃孵育1 h后洗3次，加入生物素化抗小鼠細(xì)胞因子抗體，37℃孵育1 h后洗板3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育30 min后再洗3次，加入顯色液避光反應(yīng)10 min后加入終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各細(xì)胞因子濃度。

1.5 小鼠免疫

將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、未免疫組和免疫組，每組10只。免疫組用制備的多糖結(jié)合疫苗分別于第0、14、28 d按每只小鼠2.5 μg多糖劑量進(jìn)行皮下免疫，注射體積為100 μL。末次免疫后14 d按不同劑量對(duì)未免疫組和免疫組進(jìn)行腹腔感染，并測(cè)量體溫，觀察小鼠存活情況。

1.6 小鼠感染后治療性干預(yù)

將40只BALB/c小鼠按照抗生素使用劑量隨機(jī)分為4組（0、5、10、20 mg/kg組）。小鼠以2×107CFU/只的劑量進(jìn)行腹腔感染，感染后1 h將志賀菌敏感的卡那霉素按照0、5、10、20 mg/kg體重的劑量分別經(jīng)肌肉注射，測(cè)量注射后7 h的小鼠體溫，并連續(xù)觀察計(jì)算存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用x±s表示，統(tǒng)計(jì)分析利用GraphPad Prism 8軟件完成，計(jì)量資料2組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，同時(shí)以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同感染后小鼠體溫變化

膿毒癥主要由細(xì)菌感染引起，導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)失衡，其中感染劑量與癥狀的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。為了研究感染劑量與體溫的關(guān)系，我們將不同劑量的福氏志賀菌301株經(jīng)腹腔注射后感染小鼠，評(píng)價(jià)不同劑量下小鼠體溫變化，定義體溫≤35℃為低體溫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腹腔感染前，小鼠體溫主要為36～37℃，而最高劑量組（2×107CFU/只）在感染后6 h全部為低體溫，低體溫率為100%，其中9只體溫低于30℃，最低達(dá)24.2℃，而其余劑量組均正常。隨著時(shí)間的推移，其余劑量組小鼠體溫也逐漸降低，其中 1×107、0.5×107和0.25×107CFU/只劑量組的低體溫發(fā)生率分別為60%、20%和10%（圖1A）。這一結(jié)果表明感染劑量越大越容易出現(xiàn)低體溫。此外，小鼠死亡率隨著感染劑量的提高而提高，同時(shí)死亡小鼠幾乎均在每組中體溫最低，提示低體溫與感染程度的相關(guān)性（圖1B）。

圖1 不同劑量感染后小鼠體溫及存活情況

2.2 低體溫下機(jī)體炎癥反應(yīng)及臟器損傷

以上結(jié)果表明高劑量感染下小鼠體溫顯著降低，死亡率升高，而這種急性條件下高死亡率往往與感染后血管通透性增加、血容量降低導(dǎo)致的低血容量性休克有關(guān)。為了證明這一點(diǎn)，我們以2×107CFU/只的劑量進(jìn)行腹腔感染，在感染后第8 h通過眼球取全血，可以看到與之前結(jié)果一致，感染組體溫顯著降低，均低于30℃，最低可低至24.5℃（圖2A）。此外，盡管2組小鼠體重沒有明顯變化（圖2B），但取血過程中未感染組血液流出順暢，平均取血量為722 μL，而感染組血液流出緩慢，平均每只小鼠只獲得131 μL血液（圖2C），證實(shí)了這種急性感染可明顯降低血容量。

一般情況下革蘭陰性菌感染機(jī)體后，由于內(nèi)毒素的作用，常伴隨著機(jī)體發(fā)熱，而本研究所有小鼠在感染后均出現(xiàn)低體溫。為了進(jìn)一步分析這種感染所引起的炎癥類型，我們檢測(cè)了血清中的炎癥因子。結(jié)果顯示，感染后8 h機(jī)體處于嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴，IL-1β、IL-6、IFN-γ及TNF-α等促炎因子均具有較高濃度，其中IFN-γ濃度最高，其平均值約18 000 pg/mL，盡管抗炎因子IL-10濃度也有所升高，但相對(duì)于促炎因子依然處于劣勢(shì)（圖3）。這表明在感染早期，盡管機(jī)體體溫降低，但依然以促炎為主。

為了評(píng)價(jià)這種急性期感染是否會(huì)對(duì)臟器造成損傷，我們對(duì)感染后不同臟器（心、肝、脾、肺、腎）進(jìn)行了HE染色?？梢钥吹?，與正常組織相比，心、肝、脾和肺在急性感染早期均未出現(xiàn)明顯異常，但腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫（圖4），提示腎臟可能是細(xì)菌感染的靶器官。

2.3 感染不同干預(yù)后體溫變化分析

以上結(jié)果表明嚴(yán)重的感染可導(dǎo)致低體溫膿毒癥，而在感染的幾小時(shí)內(nèi)機(jī)體即可出現(xiàn)血液灌注嚴(yán)重不足，同時(shí)處于嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴，并累及腎臟。那么這種急性感染通過干預(yù)而改善后，體溫是否也會(huì)隨之恢復(fù)？為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們采用預(yù)防性干預(yù)措施，首先對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，分別于第0、14、28 d免疫志賀菌多糖結(jié)合疫苗，同時(shí)以未免疫小鼠作為對(duì)照，末次免疫后14 d按2×107CFU/只的劑量進(jìn)行腹腔感染，感染后8 h檢測(cè)小鼠體溫，同時(shí)連續(xù)觀察7 d，計(jì)算各組存活率。結(jié)果表明免疫組小鼠低體溫癥狀顯著改善（圖5A），之后連續(xù)觀察7 d，免疫組小鼠存活率為100%，未免疫組小鼠全部死亡（圖5B）。進(jìn)一步，對(duì)免疫后小鼠以不同劑量（4×107、3×107、2×107和1×107CFU/只）進(jìn)行腹腔感染，并測(cè)定體溫動(dòng)態(tài)變化，可以看到在不同劑量感染下，免疫后小鼠均100%存活，且隨著感染劑量的降低，體溫下降程度越?。▓D5C），提示疫苗在提供保護(hù)的基礎(chǔ)上，體溫的降低程度在一定程度上反映出感染的嚴(yán)重程度。

之后，我們?cè)u(píng)價(jià)了治療性干預(yù)對(duì)體溫的影響。小鼠以2×107CFU/只的劑量進(jìn)行腹腔感染，感染后1 h經(jīng)肌肉注射，分別給予0、5、10及20 mg/kg體重的卡那霉素，測(cè)量抗生素治療7 h后的小鼠體溫。結(jié)果表明，隨著抗生素濃度的升高，小鼠存活率隨之提升（圖6A），體溫降低程度也逐漸減?。▓D6B），進(jìn)一步證明感染程度與體溫的相關(guān)性。

3 討論

膿毒癥的宿主免疫反應(yīng)被認(rèn)為是不同免疫反應(yīng)的重疊。膿毒癥在早期表現(xiàn)為SIRS，其特征是釋放許多促炎介質(zhì)，包括早期反應(yīng)細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、趨化因子、黏附分子和白三烯等[17]。此外，SIRS可通過釋放抑制性分子，如IL-10、病原體識(shí)別信號(hào)級(jí)聯(lián)抑制因子和激素等進(jìn)行反調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)也被稱為CARS，從而對(duì)過度的炎癥反應(yīng)起到抑制作用[8,18]。研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際病程發(fā)展中SIRS和CARS有相當(dāng)大的重疊，因此患者的整體免疫狀態(tài)取決于哪個(gè)反應(yīng)占主導(dǎo)地位[19]。我們的研究結(jié)果表明促炎因子IL-6和IFN-γ在血清中的濃度最高，盡管抑炎因子IL-10也有所升高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于促炎因子水平，因此可以判斷感染后小鼠處于SIRS，而此時(shí)雖然小鼠體重未發(fā)生明顯改變，但血容量顯著降低，提示炎癥導(dǎo)致血管通透性增加，循環(huán)血容量降低并累及臟器，成為小鼠死亡的重要原因之一。

圖2 小鼠感染后機(jī)體一般情況

圖3 低體溫下小鼠血清中細(xì)胞因子濃度

圖4 小鼠感染后腎臟病理變化

圖5 預(yù)防性干預(yù)后感染小鼠的存活及體溫變化

圖6 治療性干預(yù)后小鼠體溫變化

目前，膿毒癥期間體溫過低的病因尚未確定。一些研究發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子在發(fā)熱反應(yīng)的產(chǎn)生中起重要作用，這些細(xì)胞因子或者與位于下丘腦前部視前區(qū)附近的特定受體結(jié)合[20-21]，或者直接增加環(huán)氧合酶的表達(dá)，導(dǎo)致前列腺素e2的釋放，通過這些小的脂質(zhì)介質(zhì)擴(kuò)散到血腦屏障，刺激中樞從而引起發(fā)熱[20,22-23]。然而多項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，在臨床上發(fā)熱和低體溫病人血液中促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α等均沒有顯著差別，發(fā)熱和低體溫與感染的細(xì)菌類型也沒有相關(guān)性，目前不能完全證明促炎反應(yīng)的抑制與膿毒癥中的低溫有關(guān)[13-14]。而抗炎細(xì)胞因子，如IL-10，在人和動(dòng)物中具有解熱作用[24-25]，因此，過度的抗炎反應(yīng)有可能解釋低溫癥[26]。然而，我們的結(jié)果也表明，盡管血液中炎癥因子以促炎因子為主導(dǎo)，但小鼠體溫依然顯著下降，甚至低于25℃，進(jìn)一步佐證了促炎因子與低體溫之間無(wú)直接聯(lián)系。此外有研究發(fā)現(xiàn)低溫患者的精神狀態(tài)變化發(fā)生率較高[27]，提示低溫可能與下丘腦溫度中樞紊亂以及大腦神經(jīng)遞質(zhì)活性改變導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞活化標(biāo)志物CX3C趨化因子（fractalkine）在低溫下升高，提示血管功能障礙在低溫?cái)⊙Y中起作用[28]，這些線索為膿毒癥低體溫的機(jī)制研究提供了思路。

在本研究中，我們用不同劑量的細(xì)菌感染小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠低體溫率和死亡率隨感染劑量增加而增加。此外，我們分別采用預(yù)防和治療措施對(duì)小鼠膿毒癥進(jìn)行干預(yù)，并檢測(cè)體溫變化和存活情況，發(fā)現(xiàn)體溫變化與小鼠存活率具有相關(guān)性，體溫回升時(shí)小鼠存活率也隨之升高。這一結(jié)果不僅進(jìn)一步證明低體溫是死亡的危險(xiǎn)因素，同時(shí)也表明體溫的動(dòng)態(tài)變化可以作為膿毒癥改善的一個(gè)指標(biāo)，由于體溫檢測(cè)簡(jiǎn)便易行，有助于臨床快速判斷疾病發(fā)展及治療效果，為膿毒癥的及時(shí)診治提供時(shí)間。