酸棗仁黃酮對照提取物的制備及其在棗仁安神顆粒含量測定中的方法學(xué)驗證

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(1.華中科技大學(xué)協(xié)和江北醫(yī)院,武漢市蔡甸區(qū)人民醫(yī)院,湖北武漢 430100; 2.清華大學(xué)工程物理系,教育部粒子與輻射成像重點實驗室,北京 100084; 3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,教育部中藥資源與中藥復(fù)方重點實驗室,湖北武漢 430065)

中藥的活性成分是決定藥品質(zhì)量優(yōu)劣、有效性和安全性的主要因素,但其成分復(fù)雜,以單一成分為指標難以全面地評價其質(zhì)量,且單一對照品的提取分離難度大、成本高、價格昂貴,制約了中藥標準化和現(xiàn)代化的發(fā)展[1-4]。對照提取物是一類非單體成分的標準物質(zhì),其制備成本低,可對中藥進行多指標質(zhì)量控制,提高藥品檢驗效率[5-8]。2015年版《中國藥典》收載了21個對照提取物[5,9],采用標示含量的對照提取物替代單一對照品作為含量測定對照物質(zhì),是中藥質(zhì)量控制的新趨勢。

酸棗仁為鼠李科植物酸棗(ZiziphusjujubaMill. var. Spinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chou)的干燥成熟種子,收載于歷版《中國藥典》,具有寧心、安神、斂汗功效,用于虛煩不眠、驚悸怔忡、煩渴虛汗等癥,為養(yǎng)心安神的首選藥品[10-12]。酸棗仁含有斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、6?-對香豆酰斯皮諾素等黃酮類成分,此外還含有皂苷、生物堿等多種成分[13-16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃酮類是酸棗仁主要活性成分,具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、抗抑郁等作用[16-19]。2015年版《中國藥典》酸棗仁及其制劑項下規(guī)定僅以斯皮諾素的含量作為酸棗仁黃酮類成分的定量檢測指標[10,20],不能全面反映其質(zhì)量。

為提高酸棗仁及其制劑質(zhì)量與檢測效率,本文制備并標定酸棗仁黃酮對照提取物,并以此為對照,測定酸棗仁制劑中斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素兩種活性成分含量。同時,與單一對照品為對照的測定結(jié)果進行對比,為對照提取物用于酸棗仁及其制劑多指標的質(zhì)量控制提供依據(jù),探討對照提取物作為一種標準物質(zhì)在中藥質(zhì)量控制中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁粗提物 寧夏香草生物技術(shù)有限公司;棗仁安神顆粒 共12批,來源于4個廠家,具體信息見表1;斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素 上海同田生物科技有限公司;乙腈、乙酸 均為色譜純,美國Sigma-Aldrich公司;實驗用水 超純水。

表1 12批棗仁安神顆粒樣品 Tabel 1 Samples information of 12 batches Zaoren Anshen granule

島津LC-20A液相色譜系統(tǒng)(SIL-20A自動進樣器、LC-20AB四元高壓泵、CTO-20AC柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、Labsolutions色譜工作站) 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照提取物的制備 取100 g酸棗仁粗提物,加200 mL水分散,過濾,用3倍體積石油醚連續(xù)萃取3次,靜置24 h,棄去石油醚部位。取D101大孔樹脂1 kg,用95%甲醇浸泡24 h,裝柱,用水洗脫至無醇味。將酸棗仁粗提物水部位置于色譜柱內(nèi),并配制水、20%、40%、60%、95%甲醇各5 L,依次梯度洗脫,收集餾分,每瓶100 mL;利用薄層硅膠板檢測合并餾分,得到5個餾分(Fr.1～Fr.5);經(jīng)減壓回收甲醇、冷凍干燥,得到Fr.3酸棗仁黃酮提取物粉末2.3 g。

取Fr.3酸棗仁黃酮提取物粉末2.3 g,用丙酮溶解,加入5 g硅膠(100目)拌樣,溶劑揮發(fā)完全。取50 g硅膠(300目)干法裝柱,加入拌樣硅膠,用氯仿-甲醇(7∶3,V/V)等梯度洗脫,收集餾分,每瓶20 mL;利用薄層硅膠板檢測合并流份,經(jīng)減壓回收、冷凍干燥,得到酸棗仁黃酮對照提取物1.2 g。

1.2.2 混合對照品溶液的制備 將斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素作為指標成分,分別精密稱取斯皮諾素對照品6.05 mg,6?-阿魏酰斯皮諾素對照品4.03 mg于10 mL容量瓶中,加70%甲醇溶解,定容至刻度線,搖勻。移液管精密量取0.10、0.20、1.00、2.00、5.00 mL溶液,至10 mL容量瓶中,稀釋,定容至刻度,制成不同濃度的混合對照品溶液(斯皮諾素濃度為0.0061、0.0121、0.0605、0.121、0.3025 mg·mL-1,6?-阿魏酰斯皮諾素濃度為0.0040、0.0081、0.0403、0.0806、0.2015 mg·mL-1),備用。

1.2.3 酸棗仁黃酮對照提取物溶液的制備 精密稱取酸棗仁黃酮對照提取物5.00 mg,共6份,置于25 mL容量瓶中,加70%甲醇溶解,定容至刻度線,搖勻,備用,進行專屬性實驗、重復(fù)性實驗、精密度實驗、穩(wěn)定性實驗。

精密稱定酸棗仁黃酮對照提取物40 mg,置25 mL容量瓶中,加70%甲醇溶解,定容至刻度線,搖勻,靜置。移液管精密量取0.1、0.2、1.0、2.0、5.0 mL溶液,置10 mL容量瓶中,稀釋,定容至刻度,搖勻,制成不同濃度的混合對照品溶液(斯皮諾素濃度為0.0087、0.0175、0.0873、0.1746、0.4366 mg·mL-1,6?-阿魏酰斯皮諾素濃度為0.0039、0.0078、0.039、0.0781、0.1952 mg·mL-1),備用,進行線性關(guān)系考察。

1.2.4 棗仁安神顆粒供試品溶液的制備 取表1中棗仁安神顆粒樣品1～12,分別精密稱取5.00 g,研磨,加入30 mL 70%甲醇溶解,超聲30 min,常溫靜置,過0.45 μm濾膜,取濾液,靜置,備用。

1.2.5 陰性樣品溶液的制備 按2015年版《中國藥典》處方及制法,取丹參(100 g)、醋制五味子(100 g)2味藥材制得酸棗仁陰性樣品[20],并按1.2.4項制備陰性供試品溶液,備用。

表2 指標成分的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equations and linear ranges of the maker components

1.2.6 色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5C18(5 μm,4.6×250 mm2);流動相:0.1%乙酸水溶液為流動相A,乙腈為流動相B,梯度洗脫條件:0～10 min,86%→84% A;10～50 min,84%→80% A;50～60 min,80%→50% A;流速:1.0 mL·min-1;檢測器波長:335 nm[21];進樣體積:10 μL;柱溫箱溫度:22 ℃。

1.2.7 方法學(xué)考察

1.2.7.1 線性關(guān)系考察 取1.2.2項下配制的不同濃度混合對照品溶液、1.2.3項下配制的不同濃度對照提取物溶液,按照1.2.6項下色譜條件進行HPLC測定,以指標成分峰面積為縱坐標,指標成分的濃度為橫坐標,繪制標準曲線,計算各指標成分回歸方程。

1.2.7.2 專屬性實驗 取1.2.2項下配制的混合對照品溶液、1.2.3項下配制的對照提取物溶液、1.2.4項下配制的不同廠家棗仁安神顆粒供試品溶液、1.2.5項下配制的陰性樣品溶液,按照1.2.6項下色譜條件,測定指標成分。

1.2.7.3 精密度實驗 日內(nèi)精密度：取1.2.3項下配制的對照提取物溶液1份,按1.2.6項下色譜條件,連續(xù)進樣6次,測定指標成分含量,并計算峰面積RSD。日間精密度:取上述對照提取物溶液,按1.2.6項下色譜條件,6日內(nèi)每日進樣1次,測定指標成分峰面積,并計算RSD。

1.2.7.4 穩(wěn)定性實驗 取1.2.3項下配制的對照提取物溶液1份,常溫放置,分別于0、4、8、12、24 h進樣,按1.2.6項下色譜條件,測定指標成分峰面積,并計算RSD。

1.2.7.5 重復(fù)性實驗 取1.2.3項下配制的對照提取物溶液6份,常溫放置,按1.2.6項下色譜條件,測定指標成分峰面積,并計算RSD。

1.2.7.6 加樣回收率實驗 精密稱定已知含量的酸棗仁安神顆粒2.5 g,共9份,按1.2.4項制備供試品溶液,分別加入不同劑量對照提取物,分為低、中、高三個水平組,在1.2.6項下色譜條件,測定指標成分含量,計算加樣回收率和RSD。

1.2.8 對照提取物含量測定 取1.2.3項下配制的酸棗仁黃酮對照提取物溶液3份,按1.2.6項下色譜條件,每批平行操作3次,記錄峰面積,測定指標成分,以外標法計算含量。

1.2.9 棗仁安神顆粒含量測定 取1.2.4項下配制的棗仁安神顆粒供試品溶液,按1.2.6項下色譜條件,每批平行操作3次,記錄峰面積,測定指標成分,以外標法計算含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)分別由Excel、Origin 9.0和SPSS軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察 由表2可知,對照品斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素濃度在0.0061、0.3025、0.004、0.2015 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系,對照提取物中斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素濃度在0.0087～0.4366、0.0039～0.1952 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 專屬性實驗 由圖1可知,棗仁安神顆粒供試品溶液色譜圖中,在斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素保留時間處無其他成分干擾。

圖1 對照品、對照提取物、陰性樣品與不同廠家的 棗仁安神顆粒HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference standard,the standard reference extract,the negative sample and Zaoren Anshen granules from different manufacturers注:1:斯皮諾素;2:6?-阿魏酰斯皮諾素; No.1～No.4:棗仁安神顆粒樣品1、4、8、11。

2.1.3 精密度實驗 由表3結(jié)果可知,日內(nèi)精密度的斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素峰面積 RSD 分別為 0.14%、0.16%;日間精密度的斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素峰面積 RSD 分別為 0.28%、0.24%。結(jié)果表明,以斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素建立的高效液相色譜法精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗 由表3結(jié)果可知,斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素峰面積 RSD 分別為 0.15%、0.25%。結(jié)果表明溶液中斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性實驗 由表3結(jié)果可知,斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素峰面積RSD分別為 1.52%、1.93%。結(jié)果表明,以斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素建立的高效液相色譜法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率實驗 由表4結(jié)果可知,供試品溶液中斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素加樣回收率為100.26%、100.90%,說明各成分回收率良好。

表3 指標成分的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的的相對標準偏差Table 3 Precision,stability and reproducibility tests of the maker components

表4 指標成分的加標回收率Table 4 Recoveries of the maker components

2.2 對照提取物含量測定

以外標法計算斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素含量,由表5結(jié)果可知,酸棗仁黃酮對照提取物的純度為78.97%,斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素含量分別為54.57%、24.40%。

表5 酸棗仁對照提取物成分含量測定結(jié)果Table 5 Contents of the control extract of Ziziphus jujuba seeds

2.3 棗仁安神顆粒含量測定

以1.2.2項下混合對照品溶液及1.2.3項下對照提取物溶液為對照,用外標法分別計算斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素含量,由表6結(jié)果可知,以對照提取物及單體對照品為對照的2種方法測定同批次樣品的結(jié)果。

表6 12批棗仁安神顆粒中指標成分的含量Table 6 Contents of the maker components in 12 batches of Zaoren Anshen granules

將對照提取物測定12批棗仁安神顆粒中指標成分含量的結(jié)果與采用單一對照品測定的結(jié)果進行比較,由表 7 結(jié)果可知,兩種測定方法所得數(shù)據(jù)間RSD分別為0.49%～1.57%、0.52%～1.59%,均低于2%,結(jié)果表明兩種方法的測定結(jié)果之間沒有顯著性差異,以對照提取物及單體對照品為對照的2種方法測定同批次樣品的結(jié)果基本一致。

采用配對T檢驗的方法對兩種方法測得的結(jié)果進行比較,由表7結(jié)果可知,斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素相關(guān)性分析得到的相關(guān)系數(shù)分別為0.999、0.998,均大于0.95;P值分別為0.318、0.084,均大于0.05,結(jié)果表明二者之間不存在顯著性差異,以對照提取物及單體對照品為對照的2種方法測定同批次樣品的結(jié)果基本一致。

表7 棗仁安神顆粒含量測定結(jié)果相似性比較Table 7 Similarity comparison of the determination results of Zaoren Anshen granules

3 結(jié)論

斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素是酸棗仁所含的活性成分,本文自制并標定了酸棗仁黃酮對照提取物成分含量,酸棗仁黃酮對照提取物的純度為78.97%,斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素含量分別為54.57%、24.40%。將標示含量的對照提取物用于酸棗仁安神顆粒的斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素含量測定,與單一對照品測定結(jié)果進行對比,兩組數(shù)據(jù)間相對標準偏差RSD小于2%,配對t檢驗得到的相關(guān)系數(shù)大于0.95(P>0.05)。結(jié)果表明,兩種測定方法的結(jié)果無顯著性差異,酸棗仁黃酮對照提取物可以替代單一對照品對其中藥材及制劑的目標成分進行含量測定及質(zhì)量控制。

相對于單一對照品,對照提取物的分離制備難度小,便于大量制備,價格低廉,節(jié)約了研究成本。用對照提取物進行多指標成分含量測定,減少了對照品的使用,簡化了實驗操作與研究內(nèi)容,方法快速、準確。本文的研究結(jié)果初步驗證了對照提取物適用于中藥成分含量的測定及質(zhì)量控制,為對照提取物的應(yīng)用提供參考依據(jù)。