體外模擬亞硝化體系中優(yōu)選阻斷NDMA生成的香辛料精油復(fù)合抑制劑

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(1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384; 2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384; 3.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津 300384)

亞硝酸鹽通常作為發(fā)色劑、抑菌劑和抗氧化劑廣泛應(yīng)用于腌肉制品的加工中[1-2]。亞硝酸鹽是N-亞硝胺類化合物的前體物,它極易可能與肉制品加工中所存在的二級胺反應(yīng)生成N-亞硝胺[3-5]。N-亞硝胺是世界上公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一,也是四大食品污染物之一[6-7]。隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展,消費(fèi)者“保健、回歸自然”的飲食意識(shí)不斷加強(qiáng),對食品的安全性也越來越重視,食品中的N-亞硝胺類化合物的污染問題也備受關(guān)注[8-10]。

目前抑制N-亞硝胺形成的研究主要集中于提高亞硝酸鹽的清除率和阻斷N-亞硝胺形成這兩個(gè)方面[11-12]。張平等[13]確定了5.03 g的生姜提取物可以清除1 μg的亞硝酸鹽。周鳳超等[14]在亞硝酸鹽的清除試驗(yàn)中研究得出,當(dāng)加入的花椒、丁香和桂皮提取物分別為10 mL時(shí),亞硝酸鹽清除率分別為67.56%、63.22%和65.13%;同時(shí)得出,10 mL的丁香提取物對N-亞硝胺的阻斷率為78.19%,強(qiáng)于同體積的花椒(30.52%)、桂皮(39.80%)和大蒜(25.41%)。李利華[15]在對亞硝酸鹽清除試驗(yàn)中,研究得出四種不同溶劑的胡椒提取物皆具有較好的清除作用。以上研究均是單一香辛料對N-亞硝胺的阻斷作用,但是如何從眾多的香辛料中篩選出阻斷N-亞硝胺效果較好的香辛料,再將它們按一定比例配合形成復(fù)合抑制劑,起到提高肉制品風(fēng)味與阻斷肉制品中N-亞硝胺形成的雙重作用的研究報(bào)道較少。

二次回歸正交組合設(shè)計(jì),是在因子空間中選擇適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)點(diǎn),以較少的試驗(yàn)處理建立一個(gè)有效的多項(xiàng)式回歸方程,從而解決生產(chǎn)中最優(yōu)化問題的一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,目的是尋找試驗(yàn)指標(biāo)和各因子間的定量規(guī)律[16]。本研究采用單因素和二次回歸正交組合設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法,擬構(gòu)建出胡椒、姜汁、花椒、八角、丁香5種香辛料精油的回歸模型及其最優(yōu)配比,為后期開發(fā)安全、美味的肉類產(chǎn)品香辛料組合提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售常用的9種香辛料精油(胡椒、姜汁、蒜汁、花椒、桂皮、八角、丁香、小茴香、孜然) 天津頂興食品有限公司;乳化劑(PEG8000)、檸檬酸鈉、鹽酸、α-萘胺、無水乙醇、無水對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、二甲胺鹽酸鹽、碳酸鈉 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

STARTER3100酸度計(jì) 美國OHAUS公司;18Basic勻漿機(jī) 德國IKA公司;XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司;NO.NU-425-400E超凈工作臺(tái) 天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外模擬亞硝化乳化體系的制備 參照馬儷珍等[17]的方法,并稍作修改。分別吸取不同體積的不同香辛料精油至相對應(yīng)的50 mL的帶螺帽的離心管內(nèi),各加入0.05 g PEG8000,再加入一定體積的0.5 mol/L pH3.0 的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液,使其總體積為10 mL。用勻漿機(jī)B擋(13000 r/min)乳化處理后,取1 mL配制好的乳液至50 mL的帶螺帽的離心管內(nèi),加入0.5 mol/L pH3.0 的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液5.0 mL,加入1 mmol/L的亞硝酸鈉0.5 mL,再加1 mmol/L的二甲胺鹽酸鹽0.5 mL,再加入3 mL的緩沖液,使反應(yīng)體系的總體積為10 mL,在37 ℃下水浴反應(yīng)1 h。

1.2.2 NDMA的測定方法 按照1.2.1體外模擬亞硝化反應(yīng)結(jié)束后,參照馬儷珍等[17]的方法,取1.0 mL反應(yīng)的溶液至玻璃試管中,加入0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的碳酸鈉溶液終止反應(yīng),將其置于15 W 紫外燈下照射15 min,液面距燈高為15 cm,取出后立即依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的對氨基苯磺酸1.5 mL(搖勻)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的α-萘胺1.5 mL(搖勻),再加緩沖液至溶液體積精確為5.0 mL,搖勻,靜置15 min 顯色后在波長525 nm比色測定其吸光度。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 研究不同體積濃度的不同香辛料精油乳液對NDMA的抑制率。按1.2.1的方法分別吸取9種香辛料精油0.00、0.05、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,使每種香辛料精油在體外模擬亞硝化反應(yīng)中的終濃度分別為0.0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL/L(表示每L體外模擬亞硝化反應(yīng)體系中含有各種精油的mL數(shù)),反應(yīng)結(jié)束后,按1.2.2進(jìn)行NDMA的測定,空白對照組為不加香辛料精油的空白乳液,計(jì)算每一種香辛料精油在對應(yīng)體積濃度時(shí)的抑制率,并進(jìn)行分析,試驗(yàn)均重復(fù)3次。

表1 5因素二次回歸正交組合設(shè)計(jì)水平取值及編碼表Table 1 Combination design level value and coding of 5-factor quadratic regression orthogonal

將x1、x2、x3、x4、x5依次安排在常用正交表L16(215)的第1、2、4、8、15列上,將列中的數(shù)字2改成-1;加入10個(gè)星點(diǎn)號(hào)(軸點(diǎn))和6個(gè)中心點(diǎn)獲得五因素二次回歸正交組合設(shè)計(jì)[21]。

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照1.2.4將二次回歸正交組合設(shè)計(jì)得出的香辛料精油的最優(yōu)配比添加到體外模擬NDMA形成的體系中,試驗(yàn)重復(fù)6次進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 9種不同濃度香辛料精油添加對NDMA抑制效果(%)Table 2 Inhibition effects of N-dimethylnitrosamines in different volume concentrations of 9 spices(%)

注:結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3);同一行不同大寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SigmaPlot 10.0軟件作圖,采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。選擇Duncan’s多重分析法檢驗(yàn)組間顯著性,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

9種香辛料精油添加濃度不同對NDMA抑制率變化見表2。由表2可以看出,9種香辛料精油對NDMA的形成均有不同抑制效果。其中,丁香精油對NDMA的抑制率最強(qiáng),丁香精油的體積濃度在0.5 mL/L時(shí),對NDMA的抑制率為62.05%,體積濃度為5.0 mL/L時(shí),對NDMA抑制率可升高至76.81%,當(dāng)濃度繼續(xù)升高至15.0 mL/L時(shí),抑制作用并沒有顯著增強(qiáng)(P>0.05);其次胡椒、花椒和八角精油對NDMA的抑制性也較強(qiáng),體積濃度為5.0 mL/L時(shí),對NDMA抑制率均在65.0%以上,當(dāng)體積濃度再繼續(xù)增加時(shí),抑制作用保持在70.93%～74.07%范圍;而桂皮和孜然精油體積濃度升高至10.0 mL/L時(shí),對NDMA的抑制率才分別達(dá)到66.14%和64.79%;小茴香精油濃度為15.0 mL/L時(shí),對NDMA的抑制作用才能達(dá)到61.21%;姜汁和蒜汁精油對NDMA的抑制率最弱,隨著濃度的增加僅呈現(xiàn)平緩的增加趨勢,當(dāng)濃度升高至最高20 mL/L時(shí),抑制率也僅為37.19%和36.07%。

由表2可知,胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香達(dá)到最高抑制率時(shí)的體積濃度分別為15.0、15.0、15.0、10.0和5.0 mL/L,但由于香辛料精油風(fēng)味醇香濃厚,最終確定5種香辛料精油復(fù)配時(shí)的體積濃度為單因素實(shí)驗(yàn)抑制率相對較高的對應(yīng)體積濃度的1/5,雖然胡椒和八角達(dá)到最高抑制率時(shí)的體積濃度為15.0和10.0 mL/L,但是胡椒屬于辛辣型[22],八角在肉制品的加工中又有一定的應(yīng)用價(jià)值[23],而丁香精油由于其香氣濃郁,其體積濃度為胡椒的1/10,所以最終確定在二次回歸組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)中胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香零水平的體積濃度為2.0、3.0、3.0、3.0和0.20 mL/L。

由此可知,單一使用某一種香辛料精油要達(dá)到較高的濃度(5.0 mL/L以上,丁香精油除外)才能對NDMA的抑制率達(dá)到60%以上,然而在實(shí)際應(yīng)用中要考慮到產(chǎn)品的風(fēng)味,不可能添加如此高的濃度,所以我們選擇對NDMA抑制效果較好的丁香、胡椒、花椒和八角精油以較低濃度進(jìn)行復(fù)配,另外考慮到生姜精油在實(shí)際應(yīng)用中所起到的去腥、去異味等特殊作用,盡管它對NDMA的抑制率低,也考慮對其進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)選。

2.2 二次回歸正交試驗(yàn)

2.2.1 二次回歸正交試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用二次回歸正交組合設(shè)計(jì)(1/2)進(jìn)行試驗(yàn),得出的計(jì)算結(jié)果如表3所示。

2.2.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

2.2.2.1 偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn) 回歸關(guān)系方差分析見表4?；貧w關(guān)系達(dá)到極顯著水平,說明回歸方程擬合度良好,R2=0.955,說明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素、水平選擇是成功的。

表3 5因素二次回歸正交組合設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)矩陣及計(jì)算表Table 3 Structure matrix and calculation of 5-factor quadratic regression orthogonal combination design

2.2.2.2 回歸方程的失擬性檢驗(yàn) 由表4可得,擬合度F檢驗(yàn)為:FLf=4.95,失擬檢驗(yàn)不顯著,說明該方程擬合度較好,且此回歸方程在此試驗(yàn)中有一定意義。

式(1)

y=61.730+0.293x2+2.339x3+0.588x5-0.506x1x4-0.272x3x4-0.540x21-0.681x22-0.963x23-0.681x24-0.916x25

式(2)

式(3)

2.2.3 效應(yīng)分析

2.2.3.1 主效應(yīng)分析 由于數(shù)據(jù)進(jìn)行了中心化處理,消除了量綱上的差異,可直接根據(jù)回歸系數(shù)絕對值的大小來分析各種精油對NDMA抑制效果的影響[25-26]。由回歸方程(1)可知,各回歸系數(shù)絕對值的大小依次為b3>b5>b2>b1>b4,說明花椒精油和丁香精油對NDMA的抑制效果較好。

圖1 單因素與NDMA抑制率的關(guān)系Fig.1 Relationship between single factor and NDMA inhibition rate

表4 回歸關(guān)系方差分析表Table 4 Regression and variance analysis

由圖1可知,各編碼變量在-1.820～1.820取值范圍內(nèi),5個(gè)編碼因素與NDMA抑制率的關(guān)系曲線均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。其中,胡椒精油(Z1)、姜汁精油(Z2)、八角精油(Z4)和丁香精油(Z5)4種香辛料精油在編碼變量-1.820≤X≤0的取值范圍內(nèi)時(shí),編碼值與NDMA抑制率呈正相關(guān);在編碼變量0≤X≤1.820的取值范圍內(nèi),則反之;且這4種香辛料精油在編碼變量為0時(shí),NDMA的抑制率有最大值。而花椒(Z3)則在編碼變量為1時(shí),NDMA的抑制率有最大值[28-29]。

2.2.3.3 因素間交互效應(yīng)分析 由表4可知,對回歸方程偏回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),b14在α=0.5水平上有顯著性差異,表示x1(胡椒精油)與x4(八角精油)之間存在明顯的交互作用;b34雖然在α=0.25水平上沒有顯著性差異,但x3(花椒精油)與x4(八角精油)之間的交互作用相比于其他因素之間較為顯著[30-31]。

2.3 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

利用數(shù)學(xué)求極值的方法,對回歸方程(2)求一階偏導(dǎo)數(shù),尋找所得到的五元二次回歸方程的局部最優(yōu)解。對所建立的編碼回歸方程,先求其關(guān)于5個(gè)編碼變量的一階偏導(dǎo)并令其等于零[32]。用Excel解方程組得到x1=0.142、x2=0.215、x3=1.258、x4=-0.303、x5=0.321時(shí),Y有極大值;各因素Z1=2.078、Z2=3.118、Z3=3.692、Z4=2.833、Z5=0.218,即添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的體積濃度分別為2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L時(shí),由回歸方程得出抑制率的理論值為63.327%。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在體外模擬亞硝化反應(yīng)體系中添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香,添加量分別為2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L,結(jié)果表明,香辛料精油的加入對NDMA的抑制率為64.412%±0.25%,與理論值63.327%相當(dāng),說明得到的二次回歸方程與實(shí)際的擬合效果較好。

3 討論

本試驗(yàn)采用二次回歸正交組合設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)配比,對NDMA的抑制率(驗(yàn)證試驗(yàn)值64.412±0.25%)比單因素試驗(yàn)中最高的NDMA抑制率(花椒的體積濃度為15 mL/L,對NDMA的抑制率為74.07%)低10%,這是因?yàn)楹Y選的最優(yōu)配比中各濃度要遠(yuǎn)低于單一香辛料精油。在單因素試驗(yàn)中,丁香精油為0.5 mL/L時(shí),NDMA抑制率為62.05%,胡椒添加5 mL/L,對NDMA的抑制率達(dá)65.74%,而5種香辛料精油復(fù)配后,丁香精油僅需0.218 mL/L,胡椒精油僅需2.078 mL/L,NDMA抑制率即可達(dá)到64.412%±0.25%。所以,在腌肉制品加工中考慮到香辛料精油添加量對風(fēng)味的影響,本研究的復(fù)配香辛料精油在起到抑制肉制品中N-亞硝胺形成的同時(shí),還能賦予肉制品特有的風(fēng)味,這一研究結(jié)果將對安全、味美的肉制品開發(fā)具有重要的指導(dǎo)作用。

4 結(jié)論

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在體外模擬亞硝化體系中,9種香辛料精油對NDMA的生成皆有抑制作用,但抑制作用的濃度和抑制率各有不同。丁香精油對NDMA 的抑制作用最強(qiáng),其次是胡椒、花椒和八角精油,小茴香、桂皮和孜然需要較高濃度才表現(xiàn)出一定的抑制率,姜汁和蒜汁精油對NDMA的抑制率最弱。

五元二次回歸正交組合設(shè)計(jì)得到5種香辛料精油的最優(yōu)體積濃度配比為:當(dāng)胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的體積濃度分別為2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L時(shí),由回歸方程得出對NDMA的抑制率理論值為63.327%,驗(yàn)證試驗(yàn)得到抑制率為64.412%±0.25%,說明得到的模型與實(shí)際擬合度較好。