復(fù)方鉤藤口服液的制備及其對小鼠睡眠的改善

(遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室,貴州遵義 563003)

隨著社會節(jié)奏的加快及競爭的日益激烈,睡眠問題逐漸成為各種慢性疾病的源頭之一。目前臨床上采用藥物治療睡眠問題中的失眠癥有化學(xué)合成藥物和中藥治療兩大類方法,其中化學(xué)合成藥治療具有藥效發(fā)揮快、療效明確等優(yōu)點,但也存在成癮性以及耐藥性強(qiáng)等不良反應(yīng)而在使用上受到限制[1]。中藥治療失眠癥歷史悠久,歷代醫(yī)家對失眠診治的一般規(guī)律是補(bǔ)虛瀉實,多以心經(jīng)、肝經(jīng)入手來調(diào)理臟腑陰陽平衡，取得較好效果,而且許多具有天然鎮(zhèn)靜催眠功效的中草藥均安全、無毒、副作用小[2]。

復(fù)方鉤藤口服液組方主要包括:鉤藤、天麻、酸棗仁、遠(yuǎn)志、山萸肉。其中鉤藤味甘性涼,入肝、心經(jīng)可清熱平肝,鉤藤堿是鉤藤的主要有效成分之一,有顯著的中樞抑制作用,能對抗咖啡因所致的中樞興奮作用,延長小鼠的睡眠時間[3-6]。天麻甘平柔潤,入肝經(jīng)養(yǎng)液平肝,具有較好的鎮(zhèn)靜助眠功效,其主要活性成分天麻素可明顯延長閾劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠持續(xù)時間[7-10]。輔以的酸棗仁是鎮(zhèn)靜安神佳品,甘酸質(zhì)潤,可養(yǎng)血補(bǔ)肝[11];遠(yuǎn)志味苦性溫,常用于心腎不交引起的失眠多夢,健忘驚悸等[12];山萸肉入肝腎經(jīng),可補(bǔ)陰血不足;幾味藥合用可起到寧心除煩、鎮(zhèn)靜安神的功效。

因此,為開發(fā)以中草藥為原料的天然、無毒副作用的可改善睡眠功能的藥物,本研究在以經(jīng)典的鉤藤、天麻配伍基礎(chǔ)上,為突出藥物的鎮(zhèn)靜催眠功效,增加了酸棗仁、遠(yuǎn)志等,進(jìn)行合理組方,采用水提醇沉法制備了復(fù)方鉤藤口服液,并進(jìn)一步考察其對改善小鼠睡眠功能的影響,以期為復(fù)方鉤藤口服液的開發(fā)應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF雄性昆明種小鼠 160只,體重為(20±2) g 購自湖南天勤生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(湘)2014-0011),實驗動物證書號:43006700016411;鉤藤 購自貴州省劍河縣;天麻、酸棗仁、遠(yuǎn)志、山萸肉、甘草 購自遵義中藥飲片公司(經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科楊建文主任醫(yī)師鑒定為真品);鉤藤堿對照品(批號:150907)、天麻素對照品(批號:150518) 購自中國食品藥品檢定研究所;乙醇、氨水、冰醋酸 購自成都科龍化工試劑廠,均為分析純;甲醇、乙腈 購自迪馬科技有限公司,均為色譜純;戊巴比妥鈉,巴比妥鈉 購自上海化學(xué)試劑公司;實驗用水 二次蒸餾水。

RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;安捷倫1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;BT125D型分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;pH計 美國EUTEOH公司;SG3300HE型超聲清洗儀 上海冠特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)方鉤藤口服液的制備工藝 取處方中藥材(鉤藤、天麻、酸棗仁、遠(yuǎn)志、山萸肉的比例為2∶3∶3∶1∶1)加水浸泡30 min,以一定的料液比,煎煮一定次數(shù)(鉤藤在第1次煎煮后20 min加入),煎煮一定的時間,合并濾液,減壓濃縮至原體積的1/3,加入一定的濃度乙醇醇沉24 h,過濾,減壓濃縮至無醇味,加水調(diào)節(jié)濃度至含生藥0.5 g/mL,放置15 h后,用10% NaOH調(diào)節(jié)口服液的pH,加入抑菌劑(0.15%的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的等量混合物),攪拌均勻,分裝于10 mL棕色玻璃瓶中,100 ℃高溫滅菌30 min即得復(fù)方鉤藤口服液。

1.2.2 正交試驗優(yōu)選復(fù)方鉤藤口服液的制備工藝 采用L9(34)正交試驗設(shè)計優(yōu)選復(fù)方鉤藤口服液的最佳提取工藝條件,在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上選擇加水量(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(shù)(C)、醇沉濃度(D)為考察因素,每個因素3個水平,以方中君藥鉤藤和天麻藥材中的有效成分鉤藤堿和天麻素為考察指標(biāo),采用綜合評分法,設(shè)定鉤藤堿和天麻素所占權(quán)重系數(shù)各為50%,因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 TheTable of factors and levels

1.2.3 復(fù)方鉤藤口服液制劑 pH的確定:用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)口服液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,灌裝,滅菌,分別在4、40 ℃、室溫(25 ℃)條件下儲藏15 d后,觀察pH對口服液澄清度和色澤的影響。

1.2.4 復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿的含量測定

1.2.4.1 鉤藤堿的色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A):0.05%冰醋酸緩沖液(加三乙胺調(diào)節(jié)pH為7.5)(B),梯度洗脫(0 min,40% A;8 min,50% A;20 min,60% A;24 min,80% A);流速為1.0 mL/min;檢測波長243 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL[13-14]。

1.2.4.2 缺鉤藤陰性樣品溶液的制備 取組方中除鉤藤外其余藥材,按復(fù)方鉤藤口服液的制備方法制備缺鉤藤的陰性樣品溶液。

1.2.4.3 樣品溶液的制備 精密量取復(fù)方鉤藤口服液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取鉤藤堿對照品10.0 mg,用甲醇溶解定容至10 mL,得1.0 mg的鉤藤堿對照品溶液。取鉤藤堿對照品溶液,用甲醇分別配制成濃度為1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL的對照品系列溶液,分別進(jìn)樣20 μL,以峰面積A對濃度C進(jìn)行線性回歸。

1.2.5 復(fù)方鉤藤口服液中天麻素的含量測定

1.2.5.1 天麻素的色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為水∶乙腈(97∶3);流速1.0 mL/min;檢測波長220 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL[15]。

1.2.5.2 缺天麻陰性樣品溶液的制備 取組方中除天麻外其余藥材,按復(fù)方鉤藤口服液的制備方法制備缺天麻的陰性樣品溶液。

1.2.5.3 樣品溶液的制備 精密量取1.0 mL復(fù)方鉤藤口服液,用蒸餾水稀釋10倍后,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

1.2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取天麻素的對照品10.0 mg,用蒸餾水溶解定容至10 mL,得1.0 mg的天麻素對照品溶液。取天麻素對照品溶液,用蒸餾水分別配制濃度為10.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/mL的對照品系列溶液,分別進(jìn)樣20 μL,以峰面積A對濃度 C進(jìn)行線性回歸。

1.2.6 改善睡眠動物試驗 將160只健康成年雄性小鼠,隨機(jī)分成4批,每批分成對照組和復(fù)方鉤藤口服液高、中、低劑量組,每組10只。實驗組按照人體推薦劑量為0.1758 g/kg·d,以此劑量的2.5倍、5倍和10倍,經(jīng)實驗動物劑量換算后,高劑量組灌胃劑量為16 g/kg·BW、中劑量組灌胃劑量為8 g/kg·BW、低劑量組灌胃劑量為4 g/kg·BW,對照組灌胃等體積蒸餾水。4批小鼠每日灌胃一次,連續(xù)給藥30 d后,觀察小鼠喂養(yǎng)前后體重的變化情況,并分別進(jìn)行直接睡眠試驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗。

1.2.6.1 小鼠體重觀察 各組小鼠在室溫(25±1) ℃左右連續(xù)喂養(yǎng)30 d,觀察小鼠喂養(yǎng)前后體重的變化情況。

1.2.6.2 直接睡眠試驗 實驗小鼠末次灌胃30 min后,觀察各組小鼠是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo),即當(dāng)小鼠置于背臥位時,能立即翻正身位,如超過60 s不能翻正者,即認(rèn)為翻正反射消失,進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒,翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間,記錄60 min內(nèi)對照組與給藥組入睡小鼠數(shù)及睡眠時間。觀察復(fù)方鉤藤口服液是否有直接誘導(dǎo)睡眠作用[16-18]。

1.2.6.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗 實驗小鼠末次給藥30 min后,按50 mg/kg·BW劑量(預(yù)試驗確定,可使實驗動物100%入睡,但又不使睡眠時間過長的劑量)對各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉,注射量為0.2 mL/20 g·BW,以翻正反射消失為指標(biāo),在戊巴比妥鈉催眠的基礎(chǔ)上,觀察復(fù)方鉤藤口服液是否能延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間[16-18]。

1.2.6.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗 小鼠末次給藥30 min后,戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量35 mg/kg·BW(預(yù)試驗確定,即80%～90%小鼠翻正反射不消失的劑量)對各組小鼠腹腔注射,注射量為0.2 mL/20 g·BW,記錄30 min內(nèi)入睡小鼠數(shù)(翻正反射消失達(dá)60 s以上者)[16-18]。

1.2.6.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 實驗小鼠末次給藥30 min后,各組小鼠腹腔注射350 mg/kg·BW(預(yù)試驗確定,可使實驗動物100%入睡,但又不使睡眠時間過長的劑量)巴比妥鈉,注射量為0.2 mL/20 g·BW,以小鼠翻正反射消失達(dá)60 s為指標(biāo),從注射巴比妥鈉到小鼠翻正反射消失即為睡眠潛伏期,觀察復(fù)方鉤藤口服液能否縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期[16-18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿含量測定的方法學(xué)考察

在“1.2.4.1”項色譜條件下,口服液中其它成分不干擾鉤藤堿的測定,色譜圖見圖1。線性方程為A=46.36×C+13.44(r=0.9992),結(jié)果表明鉤藤堿在1.0～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取濃度為12.0 μg/mL的鉤藤堿對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣,得儀器精密度的RSD為0.2%(n=6);取“1.2.4.3”項下樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣,得方法重復(fù)性的RSD為2.7%(n=6);取“1.2.4.3”項下樣品溶液按其中鉤藤堿含量的120%、100%、80%分別添加鉤藤堿對照品溶液,其方法的平均加樣回收率為100.72%(RSD=1.09%,n=9)。

圖1 復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿的色譜圖Fig.1 Chromatograms of rhynchophylline in CUHOL 注:A：鉤藤堿對照品;B：復(fù)方鉤藤口服液; C：缺鉤藤陰性樣品;a：鉤藤堿。

2.2 口服液中天麻素含量測定的方法學(xué)考察

在“1.2.5.1”項色譜條件下,口服液中其它組分不干擾天麻素的測定,色譜圖見圖2。線性方程為A=35.173×C-8.3907(r=0.9998),結(jié)果表明天麻素在10.0～250.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取濃度為150 μg/mL的天麻素對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣,得儀器精密度的RSD為0.3%(n=6);取“1.2.5.3”項下樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣,得方法重復(fù)性的RSD為0.6%(n=6);取“1.2.5.3”項下樣品溶液按其中天麻素含量的120%、100%、80%分別添加天麻素對照品溶液,其方法的平均加樣回收率99.46%(RSD=1.29%,n=9)。

圖2 復(fù)方鉤藤口服液中天麻素的色譜圖Fig.1 The chromatograms of gastrodin in CUHOL 注:A:天麻素對照品;B:復(fù)方鉤藤口服液; C:缺天麻陰性樣品;b:天麻素。

2.3 正交試驗優(yōu)選復(fù)方鉤藤口服液的提取工藝

按“1.2.2”項下方法進(jìn)行正交試驗,結(jié)果見表2、表3。

由直觀分析結(jié)果可知,各因素對復(fù)方鉤藤口服液中指標(biāo)成分提取率影響的順序為:A>C>D>B。由方差分析結(jié)果可知加水量和煎煮次數(shù)對口服液的提取工藝影響顯著。綜合結(jié)果復(fù)方鉤藤口服液提取的最佳組合為A3B1C3D3,即加水量為生藥材的12倍、煎煮時間2.5 h、煎煮3次、醇沉濃度為70%。

表2 正交設(shè)計表及結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiment

注:綜合評分=(鉤藤堿含量/最大值)×50%+(天麻素含量/最大值)×50%。

2.4 工藝驗證

按優(yōu)化的最佳工藝制備3批樣品,其口服液中鉤藤堿和天麻素的含量測定結(jié)果如表4,鉤藤堿、天麻素的平均含量為13.69、127.90 μg/mL。結(jié)果表明優(yōu)選的制備工藝基本穩(wěn)定。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表4 復(fù)方鉤藤口服液中指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果(n=3)Table 4 Determination results of indicator components in CUHOL(n=3)

表5 不同pH和溫度對復(fù)方鉤藤口服液澄明度的影響Table 5 Effect of different pH and temperature on the clarity and color in CUHOL

注:“+”表示口服液顏色的深淺度,“*”表示溶液中的沉淀數(shù)。

表6 口服液對小鼠體重的影響Table 6 Effect of CUHOL on body weight of

注:*表示與空白對照組比較,差異顯著(P<0.05)；表6～表10同。

2.5 復(fù)方鉤藤口服液制劑pH的確定

觀察不同pH對口服液澄清度和色澤的影響,結(jié)果見表5。

從表5可知當(dāng)pH≤5.0,口服液在不同條件下外觀顏色穩(wěn)定,僅有少量沉淀產(chǎn)生,且振搖即散,故確定口服液的pH為5.0。

另外，為了防止復(fù)方鉤藤口服液制劑霉變，經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)，用0.15%尼泊金甲酯和尼泊金乙酯等量混合具有較好的抑菌防霉效果。

2.6 復(fù)方鉤藤口服液改善睡眠功能試驗研究

2.6.1 小鼠體重觀察 由表6可知,試驗前復(fù)方鉤藤口服液高、中、低三個劑量組實驗小鼠的初始體重與空白對照組相比較,無顯著性差異(P>0.05);經(jīng)過連續(xù)30 d喂養(yǎng)后,各劑量組的終體重與空白對照組的比較,差異不顯著(P>0.05),說明復(fù)方鉤藤口服液對小鼠體重的增加無影響。

2.6.2 直接睡眠試驗 由表7可知,在60 min內(nèi)各劑量組中少量小鼠出現(xiàn)安靜,嗜睡現(xiàn)象,但未觀察得到直接睡眠現(xiàn)象,對照組小鼠也未出現(xiàn)直接睡眠現(xiàn)象,即復(fù)方鉤藤口服液對小鼠無直接誘導(dǎo)睡眠作用,可進(jìn)行其他改善睡眠作用的評價。

表7 口服液對小鼠的直接睡眠作用(n=10)Table 7 Effect of CUHOL on sleep-induced directly in mice(n=10)

2.6.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗 由表8可知,高、中、低劑量組均明顯延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間,與空白對照組比較,中、高劑量組差異具有顯著性(P<0.05),說明復(fù)方鉤藤口服液可協(xié)同戊巴比妥鈉起到中樞鎮(zhèn)靜作用,8、16 g/kg·BW的劑量可顯著延長小鼠的睡眠時間。

表8 復(fù)方鉤藤口服液對延長戊巴比妥鈉 誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響(n=10)Table 8 Effect of CUHOL on prolonging pentobarbital sodium induced sleep of mice(n=10)

2.6.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗 由于戊巴比妥鈉通過肝酶代謝發(fā)揮作用,而對該酶有抑制作用的藥物,也能延長戊巴比妥鈉睡眠時間,為排除這種影響,需進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗,由表9可知,復(fù)方鉤藤口服液高、中、低劑量組的入睡率均高于空白對照組,且隨著劑量增加,小鼠入睡率也增加,三個劑量的入睡率與空白對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05),說明復(fù)方鉤藤口服液具有協(xié)同閾下劑量的戊巴比妥鈉顯著提高小鼠入睡率的作用。

表9 口服液對戊巴比妥鈉 閾下劑量催眠作用的影響(n=10)Table 9 Effect of CUHOL on subthreshold dose of pentobarbital sodium induced sleep of mice(n=10)

2.6.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 由表10可見,復(fù)方鉤藤口服液高、中、低劑量組與空白對照組比較,小鼠睡眠潛伏期均縮短,且與空白對照組比較,高、中、低三個劑量組均有顯著性差異(P<0.05)。說明復(fù)方鉤藤口服液能協(xié)同巴比妥鈉縮短小鼠的睡眠潛伏期,促進(jìn)小鼠入睡的作用。

表10 復(fù)方鉤藤口服液對巴比妥鈉 睡眠潛伏期的影響(n=10)Table 10 The effect of CUHOL on barbital sodium induced sleep latency of mice(n=10)

3 討論與結(jié)論

復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤、天麻、酸棗仁、遠(yuǎn)志均具有鎮(zhèn)靜安神或催眠之功效,文獻(xiàn)研究結(jié)果表明,鉤藤用藥劑量為12 g/kg·BW時,可使小鼠自發(fā)活動減少,使戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量致小鼠入睡個數(shù)增多,并延長戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠時間[19];天麻的鎮(zhèn)靜催眠作用已被大量實驗研究證實,其作用強(qiáng)度與天麻素含量有一定的相關(guān)性[20];酸棗仁粉劑中劑量為1 g/kg·BW時即可顯著延長小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間以及提高戊巴比妥鈉閾下催眠劑量誘導(dǎo)的小鼠睡眠發(fā)生率[21];而遠(yuǎn)志的安神功效表現(xiàn)在藥物劑量為1 g/kg·BW時可減少小鼠自發(fā)活動,延長戊巴比妥鈉閾下催眠劑量誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間[22]。由此可見,各味藥材或提取物單一使用時均有較好改善睡眠的功能,但將其進(jìn)行配伍后在改善睡眠作用方面的研究未見有報道。因此本文將上述各藥材進(jìn)行合理優(yōu)化組方后制備成便于服用的口服液制劑,并采用直接睡眠實驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗,對復(fù)方鉤藤口服液改善小鼠睡眠的作用進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明,口服液中各藥材的起效劑量均低于單一使用時的劑量,提高了口服液使用的安全性,復(fù)方鉤藤口服液高、中、低三個劑量組對小鼠無直接睡眠作用,不僅能明顯延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間,也能協(xié)同閾下劑量的戊巴比妥鈉提高小鼠的入睡率,且可協(xié)同巴比妥鈉顯著(P<0.05)縮短小鼠的睡眠潛伏期,提示復(fù)方鉤藤口服液具有改善睡眠的作用。