溫度對(duì)白菜廢棄物青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響及微生物多樣性分析

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(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050;2.甘肅省生物質(zhì)能與太陽(yáng)能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730050;3.西北低碳城鎮(zhèn)支撐技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,甘肅蘭州 730050;4.蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心,甘肅蘭州 730050)

中國(guó)是蔬菜種植、生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2017年我國(guó)蔬菜播種面積約1998.1萬(wàn)公頃,產(chǎn)量約80000萬(wàn)噸,其中白菜產(chǎn)量約11416萬(wàn)噸。隨著蔬菜的商業(yè)化流通及人們對(duì)蔬菜質(zhì)量要求的提升,每年約有30%的尾菜(蔬菜根、莖、葉、盤等)被廢棄或填埋,造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi),尾菜處理已成為蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[1]。目前,有關(guān)尾菜利用的報(bào)道多集中于肥料(直接還田、堆漚[2])、生物能源(厭氧發(fā)酵制沼氣[3])和青貯飼料[4]等方面,尾菜直接飼喂蚯蚓、黃粉蟲等也有實(shí)際應(yīng)用案例。但因尾菜具有含濕量高、易降解等特點(diǎn),實(shí)際生產(chǎn)中常出現(xiàn)尾菜尚未及時(shí)處理就腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象;而且季節(jié)性強(qiáng)、量大集中爆發(fā)式產(chǎn)出也限制了尾菜的處理效率。另外,一年四季的蔬菜種植導(dǎo)致尾菜全年都有產(chǎn)生,勢(shì)必需要能周年、不間斷、及時(shí)消納處理。蘭州地區(qū)獨(dú)特的生態(tài)氣候孕育了品種繁多、品質(zhì)優(yōu)異的“高原夏菜”,梯次播種確保了蔬菜能夠周年供給,但也面臨著不同季節(jié)的尾菜處理難題。

青貯是將青綠植物類生物質(zhì)密封貯存于厭氧環(huán)境進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,利用原料附著微生物將可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸,進(jìn)而降低pH,從而抑制腐敗微生物生長(zhǎng)繁殖,達(dá)到保質(zhì)貯存之目的[5]。Ahmadi等[6]研究表明,添加焦亞硫酸鈉對(duì)果蔬廢棄物長(zhǎng)時(shí)間厭氧保存有積極作用。Cao等[7]發(fā)現(xiàn),添加乳酸菌和甜菜粕能顯著改善生菜、甘藍(lán)菜和大白菜等尾菜的青貯品質(zhì)。Okubo等[8]認(rèn)為,添加馬鈴薯濃縮蛋白能有效提升胡蘿卜、甘藍(lán)菜葉等尾菜的粗蛋白含量和干物質(zhì)消化率。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)菜、白菜和萵筍葉等尾菜在高水分狀態(tài)下(94.2%～97.1%)青貯60 d后具有較高乳酸含量(14.8%DM～24.8%DM)和較低pH(3.6～3.9),貯存品質(zhì)良好。周苗苗等[10]認(rèn)為花椰菜莖葉在60%～70%水分含量條件下發(fā)酵60 d的青貯品質(zhì)良好?？梢?青貯不僅能及時(shí)、低成本處理尾菜,緩解腐敗變質(zhì)引發(fā)的土壤、空氣等污染問(wèn)題,還能保存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),實(shí)現(xiàn)飼料化應(yīng)用。但由于尾菜資源量較為龐大,青貯必須高效快速,混合青貯或添加劑青貯能夠延長(zhǎng)作業(yè)時(shí)間,降低處理效率。另外,貯存溫度、密度、添加劑、干物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等因素也會(huì)影響青貯品質(zhì)[11]。因此,研究探索不同季節(jié)溫度下尾菜的青貯品質(zhì)差異性和可行性尤為必要,但目前尚未見這方面的文獻(xiàn)報(bào)道。

鑒于此,本文為了解高水分尾菜在不同季節(jié)氣候溫度下的青貯可行性,提高尾菜及時(shí)轉(zhuǎn)化處理利用率,以白菜廢棄物為原料,模擬蘭州地區(qū)不同季節(jié)的氣候溫度,考察了不同溫度對(duì)尾菜青貯發(fā)酵過(guò)程中感官質(zhì)量、有機(jī)組分、發(fā)酵特性的影響,并結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)解析微生物菌群多樣性,探索不同溫度下微生物菌群與尾菜青貯品質(zhì)之間的關(guān)系,以期為實(shí)現(xiàn)尾菜資源的青貯利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菜(Brassicapekinensis(Lour.)Rupr.)廢棄物 收集自學(xué)校附近菜市場(chǎng),含水量為94.82%,可溶性碳水化合物含量為14.57%(以干基計(jì));Water DNA Isolation Kit DNA試劑盒 成都福際生物技術(shù)有限公司;蒽酮等試劑 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

SBA-40X生物傳感器 山東省科學(xué)院生物研究所;UB-7型pH計(jì) 北京丹佛儀器有限公司;F800全自動(dòng)纖維分析儀測(cè)定 山東海能科學(xué)儀器有限公司;GC9790Ⅱ氣相色譜儀 浙江富力電子科技有限公司;752N紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司;PH-070A干燥箱/培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TG16臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青貯試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理

1.2.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將收集的白菜廢棄物切碎至2 cm×2 cm后裝填、壓實(shí)、密封于青貯容器中,貯存密度為600 kg/m3,模擬蘭州地區(qū)氣候條件,設(shè)置低溫((-3±1) ℃,代表冬季室外均溫,OA組)、中溫((18±1) ℃,代表初春深秋季節(jié)均溫,RA組)和高溫((34±1) ℃,代表夏秋高溫季節(jié)均溫,HA組)3個(gè)處理,每組3個(gè)平行,連續(xù)青貯30 d后進(jìn)行分析。原料對(duì)照組命名為IA。

1.2.1.2 取樣及預(yù)處理 按照四分法稱取3份有代表性的樣品各20 g,第一份取樣打漿后經(jīng)4層紗布(18目)過(guò)濾,然后3900 r/min離心10 min得到上層液,再經(jīng)抽濾獲得浸提液,測(cè)定pH后于-20 ℃凍存,用于測(cè)定乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PPA)、丁酸(Butyric acid,BA)、乙醇(Ethanol,EA)和氨氮(Ammonia nitrogen,AN)等微生物代謝產(chǎn)物。另一份樣品經(jīng)105 ℃烘干至恒重后,粉碎過(guò)40目篩,用于測(cè)定干物質(zhì)(Dry matter,DM)、可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate,WSC)、粗蛋白(Crude protein,CP)、以及酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌木質(zhì)素(Acid detergent lignin,ADL)等有機(jī)組分。第三份樣品與200 mL無(wú)菌水混合,37 ℃恒溫振蕩2 h制得菌懸液,用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾得微生物菌體[12]。將整張帶有菌體的濾膜剪碎后置于2 mL無(wú)菌離心管中提取總DNA,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina Miseq測(cè)序。

1.2.2 感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 參考德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)青貯質(zhì)量感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),從色澤、氣味和質(zhì)地角度綜合評(píng)定,評(píng)分結(jié)果分為優(yōu)等(16～20)、尚好(10～15)、中等(5～9)和腐敗(0～4)4個(gè)等級(jí)[13]。

1.2.3 干物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)組分含量的測(cè)定 DM采用105 ℃烘干恒重法,烘干時(shí)長(zhǎng)48 h,WSC測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[14],CP測(cè)定使用K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀[15]。

1.2.4 木質(zhì)纖維組分含量的測(cè)定 NDF、ADF和ADL含量采用F800纖維測(cè)定儀,纖維素(Cellulose CL)、半纖維素(Hemicellulose HC)和綜纖維素(Holocellulose HoC)含量由公式CL=ADF-ADL、HC=NDF-ADF、HoC=CL+HC計(jì)算得出[15]。

1.2.5 發(fā)酵特性的測(cè)定

1.2.5.1 pH測(cè)定 pH用UB-7型pH計(jì)測(cè)定。

1.2.5.2 氨氮與總氮測(cè)定 氨氮采用苯酚-次氯酸比色法測(cè)定[16];總氮用K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定[15]。

1.2.5.3 有機(jī)酸含量測(cè)定 乳酸和乙醇用SBA-40X生物傳感器測(cè)定;乙酸、丙酸和丁酸等有機(jī)酸采用GC9790II氣相色譜儀測(cè)定,將樣品用6 mol/L的濃硫酸酸化至pH為3以下,再滴加數(shù)滴甲酸將pH調(diào)節(jié)至2左右,然后用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。分析采用FID檢測(cè)器,FFAP型號(hào)毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);進(jìn)樣器溫度250 ℃;柱箱溫度80～200 ℃,程序升溫8 min;FID檢測(cè)器溫度250 ℃,樣品停留時(shí)間為5 min;載氣為N2和H2,分流比1∶100;進(jìn)樣量為1 μL?？傆袡C(jī)酸(Total organic acid)為乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等小分子有機(jī)酸之和[15]。

1.2.6 細(xì)菌多樣性分析 細(xì)菌群落的高通量測(cè)序選擇擴(kuò)增區(qū)域16S r DNAv3-v4,設(shè)計(jì)正反向加上transposase sequences的引物,擴(kuò)增得到帶transposase sequences的PCR產(chǎn)物片段。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s 25個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。目的PCR產(chǎn)物用0.8倍體積AMPure XP Beads 純化后,用P5+index i5和P7+index i7引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,得到的PCR產(chǎn)物即帶有P5/P7接頭序列和雙端index。第二輪PCR產(chǎn)物用1倍體積AMPure XP Beads純化后,用Qubit ds DNA HS assay kit(Invitrogen,美國(guó))進(jìn)行熒光定量(Qubit 2.0 Fluorometer),多個(gè)樣本等量混合成測(cè)序pool。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,8個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。取10 ng的測(cè)序pool,用MiSeq Reagent Kit v3在Illumina MiSeq中進(jìn)行雙向測(cè)序,得到2×300 bp的數(shù)據(jù)。下機(jī)數(shù)據(jù)預(yù)處理后進(jìn)行生物信息學(xué)分析、多樣性分析和物種組成分析。選定相對(duì)豐度高于0.1%細(xì)菌群落制作菌群微生態(tài)分布圖,并從門、屬水平解析微生物多樣性[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)利用Excel 2007軟件整理并制作圖表,利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行了方差分析(ANOVA),并用Duncan方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn),以分析不同處理之間的差異。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示測(cè)定結(jié)果,P<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)青貯發(fā)酵感官質(zhì)量的影響

由表1可知,青貯發(fā)酵30 d后,低溫OA組和中溫RA組的感官質(zhì)量均為優(yōu)良,有明顯芳香味,廢棄白菜的物理結(jié)構(gòu)保持良好,外觀呈淡黃色;高溫HA組的顏色變?yōu)榈稚?且芳香味較弱,感官等級(jí)為尚好。但由于感官評(píng)價(jià)不確定因素較多,需結(jié)合組分分析和發(fā)酵特性分析對(duì)青貯品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)判。

表1 不同溫度處理組的感官質(zhì)量評(píng)分Table 1 Sensory quality scores of different temperature treatments groups

2.2 溫度對(duì)干物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)組分含量的影響

可溶性碳水化合物(WSC)和粗蛋白(CP)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能給乳酸菌等菌群發(fā)酵提供能量,溫度通過(guò)影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝速率來(lái)調(diào)控干物質(zhì)(DM)和有機(jī)組分含量的消長(zhǎng)變化。由表2可知,與原料相比,青貯30 d后OA組與RA組的DM含量顯著升高(P<0.05);且30 d時(shí)OA組的DM含量顯著高于RA組和HA組,但后兩者之間差異不顯著(P<0.05)。同時(shí),DM含量隨溫度升高呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榍噘A過(guò)程中乳酸菌、腸細(xì)菌和梭菌的最適溫度為37 ℃左右,這些微生物的活性在低于最適溫度時(shí)會(huì)隨溫度升高而增強(qiáng),加快了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解[18-19]。

WSC可直接被乳酸菌利用并產(chǎn)生有機(jī)酸,適宜的WSC含量有助于獲得優(yōu)良青貯品質(zhì)。和對(duì)照(0 d)相比,30 d時(shí)3個(gè)處理組的WSC含量均顯著下降(P<0.05);且隨著溫度的升高,WSC含量呈先下降后上升趨勢(shì),OA組中WSC含量顯著高于RA和HA組(P<0.05),HA組顯著高于RA組(P<0.05)。這是因?yàn)闇囟炔煌瑫?huì)導(dǎo)致微生物菌群的活性存在差異,從而產(chǎn)生不同的WSC消耗速率;低溫時(shí)微生物活動(dòng)微弱,使WSC含量保存較好。另一方面,蛋白質(zhì)在植物或微生物蛋白酶的作用下會(huì)發(fā)生降解,溫度會(huì)影響微生物及酶活性,進(jìn)而使蛋白質(zhì)分解速率產(chǎn)生差異[18]。和對(duì)照(0 d)相比,青貯發(fā)酵30 d時(shí)3個(gè)處理組CP含量均顯著下降(P<0.05),并隨溫度升高呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì),RA組中CP含量顯著高于OA和HA組(P<0.05),OA組和HA組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。可見,中溫(18±1) ℃條件有助于乳酸菌等有益微生物利用WSC繁殖代謝,并能更好地保存蛋白組分。

表2 不同溫度處理對(duì)干物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)組分含量的影響Table 2 Effect of different temperature treatment on the content of dry matter and nutrient components

注:同列不同大寫字母表示相同處理組不同時(shí)間差異顯著(P<0.05),同列不同小寫字母表示相同時(shí)間不同處理組差異顯著(P<0.05)；表3、表4同。

表3 不同溫度處理對(duì)木質(zhì)纖維組分含量的影響(g/100 g DW)Table 3 Effect of different temperatures on the content of lignocellulosic components(g/100 g DW)

2.3 溫度對(duì)木質(zhì)纖維組分含量的影響

木質(zhì)纖維含量的高低是影響青貯飼料消化率的首要因素[20]。酸性洗滌纖維(ADF)含量越低,飼用價(jià)值越高;中性洗滌纖維(NDF)含量越高,會(huì)使飼料消化率降低,從而降低青貯品質(zhì)。另一方面,木質(zhì)素、纖維素(CL)和半纖維素(HC)三種組分相互包裹、纏繞構(gòu)成復(fù)雜的木質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),也會(huì)影響動(dòng)物攝入后在體內(nèi)的消化降解性能[21]。

如表3所示,青貯發(fā)酵30 d時(shí),3個(gè)處理組中的木質(zhì)纖維組分含量發(fā)生了明顯變化。與原料相比,低溫OA組中ADF和NDF含量顯著增加(P<0.05),RA組中ADF和NDF含量顯著下降(P<0.05),而HA組中ADF和NDF含量無(wú)顯著變化(P>0.05)。3個(gè)處理組的酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)含量均顯著低于原料(P<0.05),從而使CL和HoC含量顯著增加(P<0.05)。從溫度影響角度來(lái)看,OA組中ADF、CL和HoC含量顯著高于RA組和HA組(P<0.05),且RA組中這三種組分顯著低于HA組(P<0.05)。說(shuō)明低溫和高溫青貯發(fā)酵時(shí)的纖維含量相對(duì)較高,中溫有助于減少纖維含量,提高飼用價(jià)值。

2.4 溫度對(duì)青貯發(fā)酵特性的影響

2.4.1 pH和氨氮/總氮的變化 青貯過(guò)程中對(duì)pH變化起決定作用的是乳酸菌等有益菌群,而溫度會(huì)通過(guò)影響乳酸菌繁殖代謝活性來(lái)影響青貯品質(zhì),溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于乳酸菌生長(zhǎng)[22]。優(yōu)良青貯的pH范圍一般為3.7～4.2。如圖1所示,發(fā)酵30 d時(shí)3個(gè)處理組的pH均低于4.2,且隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),RA組的pH顯著高于OA組和HA組(P<0.05),達(dá)到3.95。

氨氮/總氮(AN/TN)也是評(píng)價(jià)青貯發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。氨氮主要由植物酶和梭狀芽孢桿菌等微生物分解蛋白質(zhì)和氨基酸所產(chǎn)生,AN/TN比值越大,發(fā)酵品質(zhì)就越差。優(yōu)質(zhì)青貯的AN/TN一般低于10%[23]。試驗(yàn)中,3個(gè)處理組的AN/TN均低于5%,其中RA組和HA組的AN/TN顯著高于OA組(P<0.05),但RA組與HA組之間差異不顯著(P>0.05)。因?yàn)橹懈邷貤l件有助于蛋白分解酶活性釋放和梭菌等有害微生物繁殖,蛋白質(zhì)分解相對(duì)活躍,進(jìn)而加劇干物質(zhì)損失,這與表2中DM變化趨勢(shì)相吻合[24]。

圖1 溫度對(duì)青貯過(guò)程中氨氮/總氮(AN/TN)和pH的影響Fig.1 Effect of temperature on ammonia nitrogen/total nitrogen(AN/TN)and pH during silage注:不同的大寫字母表示相同時(shí)間 不同處理組差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 發(fā)酵中間產(chǎn)物的變化 有機(jī)酸和乙醇是青貯發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群的中間代謝產(chǎn)物,乳酸通常是由乳酸菌利用水溶性糖代謝產(chǎn)生;乙酸是乙酸菌將乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?以及異型乳酸菌分解碳水化合物所致,具有真菌抑制功效;丙酸通常由梭菌及丙酸菌生成;丁酸是由梭菌作用于乳酸和碳水化合物而生成;乙醇是異型發(fā)酵乳酸菌和耐酸酵母菌所產(chǎn)生[25-26]。由表4可知,3個(gè)處理組的乳酸含量隨溫度升高而顯著下降(P<0.05),乙酸含量則均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì);RA組的乙酸含量顯著高于其他兩組(P<0.05),丙酸和丁酸含量均低于0.1%,符合優(yōu)良青貯標(biāo)準(zhǔn)。乙醇含量隨溫度升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),RA組的乙醇含量顯著低于OA組和HA組(P<0.05)。上述小分子有機(jī)酸和醇類物質(zhì)的聯(lián)動(dòng)變化,使乳酸發(fā)酵強(qiáng)度隨溫度升高而下降,這一點(diǎn)從LA/AA和LA/TOA變化趨勢(shì)可得到印證。

表4 溫度對(duì)青貯過(guò)程中微生物發(fā)酵中間產(chǎn)物的影響(%)Table 4 Effect of temperature on microbial fermentation intermediates during ensiling(%)

2.5 不同溫度下青貯發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落多樣性

2.5.1 原始數(shù)據(jù)處理 在序列充足前提下,為提高分析結(jié)果質(zhì)量,先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理,得到優(yōu)質(zhì)序列。優(yōu)質(zhì)序列是有效測(cè)序序列中含有特異性擴(kuò)增引物、不含模糊堿基、長(zhǎng)度大于可供分析標(biāo)準(zhǔn)的序列。圖2結(jié)果顯示,3個(gè)處理組的優(yōu)質(zhì)序列均在20000條以上;三種溫度時(shí)青貯發(fā)酵后的優(yōu)勢(shì)序列均高于原料,其中RA組的優(yōu)勢(shì)序列最多為36622,為數(shù)據(jù)分析提供充足的信息來(lái)源。同樣,發(fā)酵后的OTUs數(shù)量也有明顯提高,但HA組與原料差別不大。OTUs代表了物種豐度,由于高溫HA條件與乳酸菌等有益微生物的最適繁殖溫度范圍接近,故使得乳酸菌群大量繁殖并對(duì)其他有害微生物造成競(jìng)爭(zhēng)性抑制,使物種豐富程度有所下降[27]。

圖2 不同處理組優(yōu)質(zhì)序列數(shù)及OTUs數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics of high-quality sequence and OTUs quantity in different treatment groups

2.5.2 OTUs聚類分析 OTUs(Operational taxonomic units)是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中,為分析方便,人為給某一個(gè)分類單元(品系、屬、種、分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志,OTUs數(shù)量亦代表物種豐度[28]。OTUs分布的Venn圖能統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTUs數(shù)目,直觀表現(xiàn)樣本OTUs數(shù)目組成的相似性及重疊情況。

如圖2和圖3所示,IA、OA、RA、HA三組OTUs分別為67、84、87、66。OA組與RA組的OTU數(shù)量較原料有明顯增加,HA組豐度較原料有所降低,不同樣品所含OTUs數(shù)量依序?yàn)镽A>OA>IA>HA,說(shuō)明中溫青貯時(shí)微生物類群最為豐富。其中,發(fā)酵后三個(gè)處理組共有的OTUs數(shù)量為49個(gè),并且與原料相比,三個(gè)處理組都有其獨(dú)有的OTUs,特別是OA組中獨(dú)有的OTUs能夠占到其全部OTUs的46.4%,說(shuō)明不同溫度下青貯樣品的物種多樣性存在有一樣的微生物類群,但受到溫度不同的影響而產(chǎn)生了獨(dú)特的群落差異[29]。

圖3 維恩圖Fig.3 Venn diagram

2.5.3 稀釋曲線 稀釋曲線可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性,并間接反映樣品的物種豐富度。從稀釋曲線(圖4)來(lái)看,樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量為24492,隨著測(cè)序數(shù)量的增加,稀釋曲線斜率逐漸降低,趨向平坦但未進(jìn)入平臺(tái)期,但更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTUs,因此本次測(cè)序結(jié)果較為準(zhǔn)確合理[12]。由圖4還可知,高溫HA組的數(shù)量最低,中溫RA組數(shù)量最高,說(shuō)明中溫青貯發(fā)酵時(shí)的微生物豐富度較好,這與圖2和圖3中結(jié)果信息相吻合。

圖4 稀釋性曲線Fig.4 Dilution curve

2.5.4 Alpha多樣性 表達(dá)Alpha多樣性的Coverage、Chao、Ace和Shannon等指數(shù)分別用于評(píng)估物種的測(cè)序深度、豐度和多樣性。Coverage指數(shù)能反映樣本真實(shí)情況,數(shù)值越高,則樣本中序列未被測(cè)出的概率越低;Chao和Ace指數(shù)屬于群落豐度指數(shù),數(shù)值越大,表明微生物群落豐度越高;Shannon和Simpson指數(shù)用來(lái)估算微生物多樣性,Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越低,表明樣品微生物多樣性越高[29]。如表5所示,與原料相比,3個(gè)青貯處理組的Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均有所增加,說(shuō)明發(fā)酵后的微生物群落豐富度均有所升高。另一方面,OA組的Shannon指數(shù)上升,Simpson指數(shù)下降,說(shuō)明OA組的微生物多樣性處優(yōu)勢(shì)地位。所有樣品的Coverage數(shù)值都較大,說(shuō)明結(jié)果可以代表樣本微生物群落的真實(shí)情況。

2.5.5 基于PCA的群落結(jié)構(gòu)分析 PCA分析是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化分析的技術(shù)。通過(guò)分析不同樣本OTU(97%相似性)組成可以反映樣本間的差異,如樣本組成越相似,反映在PCA圖中的距離越近[12]。如圖5所示,每個(gè)點(diǎn)分別代表了一個(gè)樣品,主成分分析共提取了3個(gè)主成分,其中第一主成分PC1和第二主成分PC2貢獻(xiàn)率分別為48.80%和21.24%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了70.04%,可以解釋變量的絕大部分信息。原料IA組與青貯發(fā)酵后3個(gè)處理組樣品的距離均比較遠(yuǎn),說(shuō)明發(fā)酵前后樣品的微生物群落有明顯變化;RA組與HA組距離較近,說(shuō)明二者相似性較高。

圖5 原料和不同處理組的主成分分析(PCA)Fig.5 Principal component analysis(PCA) for raw material and different treatments

2.5.6 多樣本相似度樹狀圖 多樣本相似度樹狀圖利用樹枝結(jié)構(gòu)描述和比較多個(gè)樣本間的相似性和差異關(guān)系。如圖6所示,4組數(shù)據(jù)可分為兩大類,其IA單獨(dú)為一個(gè)分支,與其他樣品的群落組成差異性較大;RA、OA與HA均在第二分支上,說(shuō)明其趨同性較高。

圖6 原料和不同處理組的多樣本相似度樹狀圖Fig.6 Multi-sample similarity tree for raw material and different treatments

2.5.7 門分類水平細(xì)菌群落組成 由圖7可知,原料IA組的門水平優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes),豐度分別為80.23%和18.57%。青貯發(fā)酵后細(xì)菌群落主要演變?yōu)樽冃尉T(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和藍(lán)藻(Cyanobacteria)等。其中OA組的門水平優(yōu)勢(shì)菌主要有變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes),豐度分別為47.19%和49.01%,RA組中的變形菌門(Proteobacteria)豐度降為12.07%,厚壁菌門(Firmicutes)豐度增至87.27%,HA組的變形菌門(Proteobacteria)豐度降至16.67%,而厚壁菌門(Firmicutes)的菌群豐度為82.39%,說(shuō)明中高溫青貯時(shí)厚壁菌門(Firmicutes)門細(xì)菌占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。

變形菌門(Proteobacteria)是革蘭氏陰性菌,包括大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌[30],它們會(huì)與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)性利用WSC,并造成CP含量下降和氨氮含量升高。厚壁菌門(Firmicutes)是低GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌,主要有產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群,可以降解很多大分子化合物,如淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素等[31]。發(fā)酵后變形菌門(Proteobacteria)豐度的降低和厚壁菌門(Firmicutes)豐度的升高使青貯料中的CP、NDF和ADF含量均有下降趨勢(shì),這與表3中結(jié)果一致。可見,厚壁菌門是引起粗蛋白和纖維素等有機(jī)組分變化的主要因素。

圖7 門分類水平上的細(xì)菌群落組成Fig.7 Bacterial community composition at the Phylum level

2.5.8 屬分類水平細(xì)菌群落組成 屬水平細(xì)菌群落組成如圖8所示。原料IA附著的細(xì)菌主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和腸桿菌屬(Enterobacter)等,其中優(yōu)勢(shì)菌假單胞菌屬(Pseudomonas)豐度最高為48.40%。低溫發(fā)酵后OA組中的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度為28.43%,耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersnia)和腸桿菌屬(Enterobacter)豐度次之,分別為19.50%和17.13%,此外還有少量明串珠菌屬(Leuconostoc,11.02%)、泛菌屬(Pantoea,8.62%)和乳球菌屬(Lactococcus,5.73%)等。中溫RA組和高溫HA組的細(xì)菌群落構(gòu)成類似,優(yōu)勢(shì)菌都演變?yōu)槿樗釛U菌屬(Lactobacillus),豐度分別高達(dá)80.07%和74.63%。另外,RA組中的腸桿菌屬(Enterobacter)豐度為8.62%,明串珠菌屬(Leuconostoc)豐度為6.19%,泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和黃桿菌屬(Flavobacterium)等細(xì)菌豐度均低于1%;HA組中腸桿菌屬(Enterobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersnia)豐度分別為11.24%、5.98%和4.37%。另一方面,OA組中演繹生成乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯式菌屬(weissella)、腸球菌屬(Enterococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)等乳酸細(xì)菌的總豐度之和僅為48.92%,腸桿菌屬(Enterobacter)和耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersnia)等腐敗菌豐度較高達(dá)到36.63%,而RA組和HA組的乳酸菌屬豐度之和分別高達(dá)87.14%和82.29%,使腸桿菌屬(Enterobacter)等有害微生物被有效抑制。從乳酸細(xì)菌多樣性來(lái)看,廢棄白菜青貯發(fā)酵后的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)比重均有明顯增加,并占據(jù)主導(dǎo)地位。這與Yan和劉晶晶等[27,32]報(bào)道的柳枝稷、黑麥草青貯發(fā)酵時(shí)乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)果一致。

圖8 屬分類水平上的細(xì)菌群落組成Fig.8 Bacterial community composition at the genus level

總體來(lái)看,原料青貯前自身表面附著的乳酸菌群較少,生長(zhǎng)繁殖緩慢,并與其他微生物存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。一旦進(jìn)入青貯發(fā)酵,乳酸菌等有益菌不斷繁殖進(jìn)而產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸從而降低pH,抑制其他腐敗微生物生長(zhǎng),并且隨著溫度升高,有利于提升青貯品質(zhì)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)逐漸演變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌群。結(jié)合圖5和圖6結(jié)果綜合判斷,青貯發(fā)酵溫度的不同導(dǎo)致了微生物菌群種類及其豐度不斷發(fā)生變化。

3 結(jié)論

廢棄白菜青貯發(fā)酵30 d時(shí)能獲得良好的感官質(zhì)量,得益于乳酸菌群的發(fā)酵代謝。青貯過(guò)程中,乳酸菌等有益菌利用可溶性碳水化合物繁殖代謝產(chǎn)生乳酸和乙酸等有機(jī)酸,從而保存粗蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。中溫青貯30 d時(shí)的粗蛋白被有效保存,含量達(dá)到18.04 g/100 g DW,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值良好;酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量分別比原料減少了5.99 g/100 g DW和6.03 g/100 g DW,木質(zhì)素含量減少了32.46 g/100 g DW,有助于提高動(dòng)物飼喂過(guò)程中的降解消化性。另一方面,中溫(18±1) ℃青貯發(fā)酵有助于提升微生物豐富度和多樣性,使厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus)在青貯發(fā)酵期間占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度高達(dá)80%以上,保證了廢棄白菜的良好青貯發(fā)酵。因此,建議生產(chǎn)中在中溫條件下進(jìn)行廢棄白菜的青貯發(fā)酵,能獲得良好青貯品質(zhì)。