功能化磁性納米材料在磷酸化肽富集中的應(yīng)用

熊芳芳, 江丹丹, 賈 瓊

(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 吉林 長春 130012)

蛋白質(zhì)磷酸化是一種由激酶和磷酸酶共同調(diào)控的可逆性翻譯后修飾。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面電荷分布,從而對酶活性和蛋白質(zhì)之間的相互作用產(chǎn)生影響[1,2]。因此,蛋白質(zhì)磷酸化與各種細(xì)胞過程密切相關(guān),包括細(xì)胞代謝、生長、增殖、分化以及凋亡[3,4]。在真核細(xì)胞中,最常見的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)位于酪氨酸、蘇氨酸及絲氨酸殘基上,其比例約為1∶200∶1 800。據(jù)估計,在真核細(xì)胞中大約存在70萬個潛在的磷酸化位點(diǎn)[5,6]。然而蛋白質(zhì)磷酸化過程是動態(tài)的,只有比例很小的位點(diǎn)在特定時刻同時被磷酸化。因此,磷酸化蛋白質(zhì)的含量比較低(僅僅占細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總含量的1%～2%),并且酶解磷酸化蛋白質(zhì)后產(chǎn)生的磷酸化肽的豐度值更低[7]。蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié)是一個非常復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)過程,其異常的調(diào)節(jié)會導(dǎo)致人類許多疾病,如糖尿病、白血病、癌癥和老年癡呆癥等[8,9]。因此,分析研究蛋白質(zhì)磷酸化過程是一個具有挑戰(zhàn)性且意義重大的課題,近年來也成為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。

目前,基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)的鑒定技術(shù)是識別磷酸化蛋白質(zhì)/肽的一種強(qiáng)有力的工具。然而由于內(nèi)源性磷酸化肽的總含量和離子化效率十分低,通過MS很難直接檢測到復(fù)雜的生物樣品中的磷酸化肽[10]。因此,發(fā)展高選擇性和高靈敏的分離富集策略和技術(shù),對磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定是十分必要的。近年來,出現(xiàn)了各種針對磷酸化肽的分離方法,包括離子交換色譜法[11]、免疫親和法[12]、固定化金屬離子親和色譜(IMAC)法[13,14]、金屬氧化物親和色譜(MOAC)法[15,16]等。為了將親和材料從所處的介質(zhì)中與靶分子有效地分離開來,將納米材料磁化可以簡化分離步驟和縮短分離時間。磁性納米復(fù)合材料以其獨(dú)特的功能和可分離性在磷酸化肽的富集方面受到越來越多的關(guān)注[17]。

磁性納米粒子作為一種新型的納米材料誕生于20世紀(jì)80年代末,發(fā)展的速度十分迅速。它在外界磁場的存在下可以展現(xiàn)出良好的磁響應(yīng)性[18,19]。許多納米粒子都具有磁性,最為常見的有兩大類:第一類主要是金屬及其合金,包括Fe、Co、Ni、Fe-Co及Fe-Ni合金等;第二類主要是MeFe2O4(Me=Mn、Co、Ni)、γ-Fe2O3及Fe3O4等。其中,Fe3O4由于具有生物相容性好、制備簡便等特點(diǎn),被廣泛地應(yīng)用于許多領(lǐng)域,如載藥、核磁共振、分離富集等[20]。此外,裸露的磁性納米粒子具有很高的化學(xué)活性,在空氣中很容易被氧化,通常會導(dǎo)致磁性和分散性的喪失。因此,對于許多應(yīng)用、開發(fā)保護(hù)策略以化學(xué)穩(wěn)定磁性納米粒子在合成過程中或合成后的降解是至關(guān)重要的。結(jié)合磷酸化肽的富集策略,功能化磁性納米材料既體現(xiàn)了功能化分子或基團(tuán)對磷酸基團(tuán)的親和性,又具有良好的超順磁性,便于實(shí)現(xiàn)簡便快速的磷酸化肽分離過程。功能化磁性納米材料在磷酸化肽的富集中有著舉足輕重的地位,在下文中將著重介紹磁性納米粒子的功能化及在磷酸化肽的富集中的應(yīng)用。主要分為以下幾類:基于金屬氧化物-磷酸基團(tuán)相互作用的磁性富集材料、基于金屬離子-磷酸基團(tuán)相互作用的磁性富集材料、基于靜電相互作用/氫鍵的磁性富集材料。

1 磁性納米粒子的制備

近年來,許多科研工作者都致力于制備Fe3O4納米粒子的研究。常用的方法包括共沉淀法[21,22]、熱分解法和/或還原法[23,24]、微乳液合成[25,26]、水熱合成[27,28]、溶膠-凝膠和多元醇合成[29,30]、微波等離子體合成[31]、聲化學(xué)反應(yīng)[32]、冷凍干燥[33]、流動注射合成[34]、電噴霧合成[35]、激光熱解技術(shù)[36]等,都可以用來制備高質(zhì)量的磁性納米粒子。共沉淀法、熱分解法和微乳液法是合成粒徑小于30 nm的常用方法,而水熱法和自組裝法一般適用于合成粒徑大于100 nm的磁性粒子。可以通過采用不同的制備條件和方法,對生成的Fe3O4納米粒子進(jìn)行調(diào)控,包括表面形貌、粒徑尺寸等,以滿足應(yīng)用要求。

2 磁性納米粒子的功能化

磁性納米粒子的一個不可避免的問題是它們在較長時間內(nèi)的內(nèi)在不穩(wěn)定性,主要表現(xiàn)在兩方面:(1)分散性損失,即小的納米粒子易于聚集形成大的粒子以降低表面能量;(2)失去磁性,由于化學(xué)活性高,裸磁性納米粒子很容易在空氣中氧化,特別是Fe3O4和γ-Fe2O3納米粒子。因此,開發(fā)一種合適的保護(hù)策略在后續(xù)應(yīng)用過程中或之后的損傷是至關(guān)重要的。目前,已經(jīng)有不同的方法被報道以實(shí)現(xiàn)磁性納米粒子的功能化,包括原位涂層和合成后涂層。常用的功能化材料包括如下幾類:(1)表面活性劑和小分子[37-40]: -OH、-COOH、-NH2、-SH,這些基團(tuán)可以通過附著不同的生物活性分子進(jìn)行進(jìn)一步修飾,以適應(yīng)不同的應(yīng)用場合;硅烷作為一種小分子,常被改性和賦予官能化端基到裸磁性納米粒子表面,3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、氨基苯基三甲氧基硅烷(APTS)和巰基丙基三乙氧基硅烷(MPTES)試劑是最常見的硅烷化試劑并用于錨定-NH2和-SH。(2)聚合物[41-47]:包括聚天冬氨酸、多糖、海藻酸鹽、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚(D,L-丙交酯)、殼聚糖和聚甲基丙烯酸甲酯。(3)二氧化硅[48,49]:是一種用于基礎(chǔ)研究和生物應(yīng)用的經(jīng)典而重要的復(fù)合材料。由于二氧化硅層可以屏蔽磁性離子之間的磁偶極引力,因此二氧化硅涂層可以增強(qiáng)溶液中的分散性。(4)碳[50,51]:碳涂層提供了一個有效的氧化屏障,并防止腐蝕磁芯材料。其中,氧化鐵納米粒子核表面的親水碳涂層具有較好的分散性和穩(wěn)定性。

功能化修飾的磁性納米粒子的結(jié)構(gòu)組成可以主要?dú)w為以下4類:核-殼型、殼-核型、殼-核-殼型、鑲嵌型,目前制備的比較多的兩類是核-殼型和鑲嵌型。

(1)核-殼型:核-殼型結(jié)構(gòu)以磁性納米粒子為核,將磁核外部功能化修飾上無機(jī)或有機(jī)材料作為殼層,以提高其對目標(biāo)分析物的特異性。一般會將硅烷化試劑作為核-殼型磁性納米材料的殼層,通過硅烷化試劑與磁性Fe3O4納米粒子的Fe原子形成化合鍵,可引入氨基、苯基或者巰基等其他基團(tuán),然后將其與表面活性劑、離子液體、金屬氧化物、大環(huán)化合物和多孔骨架材料等其他材料進(jìn)行結(jié)合[52-55]。

Zhao等[56]制備了表面活性劑修飾的磁性納米粒子,用于環(huán)境水樣中酚類化合物的移除,該方法得到的濃縮倍數(shù)為1 600。Zhou等[57]合成了具有雙特異性識別位點(diǎn)的磁性聚離子液體材料,并與石墨爐原子吸收光譜聯(lián)用,富集檢測痕量貴金屬Au、Pd、Pt,所得到的回收率為88.3%～116.3%。Hong等[58]在磁性二氧化硅包覆層表面修飾TiO2-NiO后將其用于磷酸化肽的富集,結(jié)合LC-MS/MS檢測,從HeLa細(xì)胞提取物中鑒定出972個特異性磷酸化肽。Li等[59]將共價有機(jī)骨架材料修飾在磁性氨基包覆層表面,并將其用于水中雙酚類物質(zhì)的富集,結(jié)合紫外可見分光光度計檢測,對雙酚A和雙酚AF的飽和吸附量分別達(dá)到了160.6和236.7 mg/g。

(2)鑲嵌型:鑲嵌型是指以有機(jī)或無機(jī)材料為主體,將Fe3O4鑲嵌在其表面。主體材料的比表面積通常比較大,且易于被功能化修飾上特定基團(tuán)。其中,石墨烯具有蜂巢狀的晶格結(jié)構(gòu)、二維的納米結(jié)構(gòu)、較高的比表面積,是目前使用十分廣泛的主體材料[60-64]。對石墨烯進(jìn)行氧化反應(yīng)可以得到氧化石墨烯,其含有的羥基、環(huán)氧基及羧基等基團(tuán)便于下一步的修飾改性。

Shao等[65]采用原位共沉淀法制備了磁性葫蘆[6]脲/氧化石墨烯復(fù)合吸附劑,將該復(fù)合材料用于從水溶液鈾離子的去除,飽和吸附量達(dá)到122.48 mg/g。Wang等[66]采用自組裝方法制備了共價有機(jī)骨架材料功能化的磁性石墨烯生物復(fù)合材料(MagG@COF-5)。所制備的材料親水性超強(qiáng),可以有效地識別N-糖肽。MagG@COF-5復(fù)合材料在N-糖肽分析中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能,檢測限低至0.5 nmol/L,尺寸排阻效果好,可重復(fù)利用性好。

3 功能化磁性親和材料在磷酸化肽富集中的應(yīng)用

3.1 基于金屬氧化物-磷酸基團(tuán)相互作用的磁性富集材料

金屬氧化物是根據(jù)路易斯酸堿理論實(shí)現(xiàn)對磷酸化肽富集的?；诮饘傺趸?磷酸基團(tuán)相互作用的磁性富集材料通常由Fe3O4磁核和具有親和能力的金屬氧化物殼層組成的。2005年,Chen等[67-69]將金屬氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3和Ga2O3)包覆于磁球表面用于磷酸化肽段的富集。首先利用正硅酸乙酯或硅酸鈉在Fe3O4磁球表面包覆一層SiO2殼形成磁性硅球,而后通過水解將鈦酸丁酯、鋯酸丁酯、三異丙醇鋁及三異丙醇鎵包覆于硅球上,最終形成金屬氧化物包覆的磁球[70-72]。這些磁球用于磷酸化肽段的富集均取得了較好的結(jié)果。

為了提高吸附材料的比表面積,研究者們將二維材料引入了磷酸化肽的富集研究中,如石墨烯等。Li等[73]設(shè)計合成了二元金屬氧化物包覆的多巴胺(PD)修飾的磁性石墨烯(magG)復(fù)合材料magG/PD/(Zr-Ti)O4,并應(yīng)用于磷酸化肽的富集研究。所制備的復(fù)合物比表面積大,生物相容性好,超順磁性強(qiáng),對磷酸化肽的親和能力高。對比了magG/PD/ZrO2、magG/PD/TiO2以及它們的復(fù)合材料的富集效率,結(jié)果表明復(fù)合材料具有較高的靈敏度(1 μg/L)和選擇性(β-酪蛋白與牛血清蛋白的質(zhì)量比達(dá)1∶8 000)。此外,以小鼠腦組織為實(shí)際樣品,進(jìn)一步證明了該材料對磷酸化肽具有高的捕獲能力。

隨著二維材料及其復(fù)合材料的制備技術(shù)不斷提高,更多新型的二維材料不斷地被開發(fā)出來,如鈦酸鹽、鈮酸鹽和鈦鈮酸鹽納米片等。這些二維材料比表面積比較大,且路易斯酸位點(diǎn)十分豐富,為磷酸化鈦的富集提供了可能性。Li等[74]通過簡單的陽離子交換方法制備了包埋有Fe3O4納米粒子的鈮鈦酸鹽納米復(fù)合材料,并用于磷酸化肽的捕獲和同位素標(biāo)記。在該材料中,Fe3O4不僅提供了磁響應(yīng)性能,而且還保持了鈮鈦酸鹽納米片的二維結(jié)構(gòu)。合成的Fe3O4-TiNbNS由于具有較高的活性表面積、豐富的路易斯酸位點(diǎn)和優(yōu)良的磁響應(yīng)性,在磷酸化肽的捕獲和同位素標(biāo)記反應(yīng)中表現(xiàn)出比塊狀金屬氧化物及層疊狀氧化物更優(yōu)越的靈敏度、選擇性和吸附容量。通過結(jié)合原位同位素標(biāo)記法,成功地檢測了白血病患者血清中異常調(diào)節(jié)的磷酸化肽。

3.2 基于金屬離子-磷酸基團(tuán)相互作用的磁性富集材料

近年來,磁性納米粒子結(jié)合IMAC應(yīng)用于磷酸化肽富集研究的文獻(xiàn)較多。通常由Fe3O4納米粒子作為磁核,中間為螯合劑(如亞氨基二乙酸(IDA)、氨三乙酸(NTA)、殼聚糖或其他有機(jī)高分子聚合物等),外殼為金屬離子(如Zn2+、Fe3+、Ce4+、Zr4+、Ti4+等),形成核-殼結(jié)構(gòu)的磁性IMAC雜化材料[75-78]。例如,Li等[79]制備了Fe3+螯合的二氧化硅磁性微球,首先通過溶劑熱反應(yīng)制備磁性微球,然后用正硅酸乙酯修飾,形成二氧化硅包裹的磁性微球。隨后,用3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)與IDA反應(yīng)得到的硅烷偶聯(lián)劑(GLYMO-IDA)對二氧化硅磁性微球進(jìn)行接枝,最后將Fe3+螯合在微球的表面上得到微球。該微球?qū)崿F(xiàn)了對磷酸化肽簡單、高效、特異性地富集。

Wang等[80]合成了一種新型的磁性IMAC材料,將透明質(zhì)酸(HA)和殼聚糖(CS)逐層修飾到Fe3O4@SiO2納米粒子表面形成親水性殼層,最后連接上Ti4+。所制備的Fe3O4@SiO2@(HA/CS)10-Ti4+材料具有超順磁性、親水性及高Ti4+含量的特點(diǎn),對磷酸化肽實(shí)現(xiàn)了高選擇性的捕獲。結(jié)合MS檢測,實(shí)現(xiàn)了檢出限低(0.5 nmol/L)、吸附容量高(100 mg/g)、回收率高(85.45%)和快速磁分離(10 s)。

Chen等[81]報道了Ga3+螯合的三磷酸腺苷(ATP)功能化的磁性納米粒子(MNPs)對磷酸化肽的富集研究。制備的Ga3+-ATP-MNPs成功地用于大鼠肝線粒體的磷酸化蛋白質(zhì)/肽的分析,識別到了158種磷酸化蛋白質(zhì)、193種磷酸化肽及331個磷酸化位點(diǎn),其中54.4%的磷酸化肽具有多個磷酸化位點(diǎn)。Ga3+-ATP-MNPs對多磷酸化肽的高特異性可能是由于協(xié)同了ATP的強(qiáng)親水性與Ga3+的強(qiáng)親和能力。此外,Ga3+-ATP-MNPs實(shí)現(xiàn)了直接板上富集后進(jìn)行MALDI-TOF MS分析,檢測限低至30 pmol/L。

3.3 基于靜電相互作用/氫鍵的磁性富集材料

在磁性材料表面引入帶正電荷的親水性修飾基團(tuán),可使材料通過靜電相互作用/氫鍵吸附帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán),從而實(shí)現(xiàn)對磷酸化肽的富集。因此一些富含氨基的化合物,如聚乙烯亞胺、1,6-己二胺、胍基硅烷化試劑等被修飾到Fe3O4的表面,用以捕獲磷酸化肽。Chen等[82]制備了聚乙烯亞胺修飾的Fe3O4納米粒子,該材料在pH 3～11之間攜帶正電荷,可以特異性地從蛋白質(zhì)混合物中捕獲磷酸化肽,所需富集時間僅為1 min。Zhang等[83]利用一鍋法制備了1,6-己二胺修飾的磁性納米粒子,該材料依次實(shí)現(xiàn)了選擇性捕獲糖肽和磷酸化肽。以多肽/磷酸化肽/糖肽摩爾比為10∶1∶1的混合物為分析樣品,對糖肽和磷酸化肽的回收率分別為76%和88%。此外,肽段序列覆蓋率從25.6%增加到51.8%,相當(dāng)于模型蛋白質(zhì)(去唾液酸胎球蛋白)的102%。這些新識別到的磷酸化肽和糖肽提供了額外的序列信息,有利于蛋白質(zhì)的后續(xù)分析。Deng等[84]制備了胍基功能化的超順磁性納米微球以3-胍丙基三乙氧基硅烷(GDN)為功能化單體,對Fe3O4@SiO2進(jìn)行改性得到Fe3O4@SiO2@GDN。所制備的材料能夠高選擇性地捕獲磷酸化蛋白質(zhì),對標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)具有較高的結(jié)合能力,其中對卵清蛋白和β-酪蛋白的吸附容量分別為78.8和59.6 mg/g。Xiong等[85]在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯修飾的Fe3O4微球上引入胍基,制備了具有可調(diào)控特異性的親和材料。通過簡單地調(diào)節(jié)緩沖液成分,實(shí)現(xiàn)了對單/多磷酸化肽的可調(diào)控富集,取得了較高的富集能力(200 mg/g)、檢測靈敏度(0.5 nmol/L)及回收率(91.30%)。

4 結(jié)論與展望

通過高效、簡單、快速和方便的磁分離方式,將磁性親和探針應(yīng)用于實(shí)際生物樣品中磷酸化肽的分離富集,可以取得良好的效果。然而,嚴(yán)格可控的形狀和大小分布的磁性離子的形成仍然是一個挑戰(zhàn),不同條件下氧化鐵的形成機(jī)理還有待研究。還需要解決諸如生物相容性、毒性、體內(nèi)和體外靶向效率以及功能化離子的長期穩(wěn)定性等問題。因此,開發(fā)和設(shè)計出新型的、多功能的親和納米探針材料應(yīng)用于磷酸化肽的富集[86-90],通過二維結(jié)構(gòu)化、介孔化、多位點(diǎn)化等手段來增加親和探針的比表面積以及豐富結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步提高磷酸化肽的選擇性、檢測靈敏度和吸附容量,依舊是該研究領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。隨著人們深入研究和探索功能化磁性納米探針材料對磷酸化肽的富集原理和相互作用機(jī)制,發(fā)展一些具有富集效果好和效率高、應(yīng)用性強(qiáng)的功能化磁性納米材料,將會大大推進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展,也會在生物醫(yī)學(xué)中磷酸化肽生物標(biāo)記物的檢測中有很大的應(yīng)用前景。