槐耳顆粒逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥的初步研究

張正光，劉冰，梁煒?shù)h，沈存思

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029)

肝癌是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生存[1]。由于肝癌發(fā)病隱匿，許多肝癌患者在確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)段,即便進(jìn)行手術(shù)治療，也難以取得良好治療效果。索拉非尼(Sorafenib)是目前臨床上用于治療晚期肝癌、腎癌的一線藥物[2-4]，是一種新型多靶點(diǎn)抑制劑。然而，Sorafenib的獲得性耐藥現(xiàn)象在臨床上普遍存在，使其應(yīng)用受到了極大限制[5]。因此，如何降低Sorafenib的耐藥性，是醫(yī)藥界治療中晚期肝癌亟待解決的問(wèn)題。

槐耳顆粒由真菌類中藥槐耳經(jīng)過(guò)現(xiàn)代技術(shù)工藝加工研制而成，具有扶正固本，活血消癥的功效，常被用于不宜手術(shù)的原發(fā)性肝癌的治療，對(duì)化療藥起著增效減毒的作用[6-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，槐耳顆粒與Sorafenib聯(lián)合用藥相比單用Sorafenib治療晚期肝癌，其臨床療效有較大的提升，同時(shí)腹瀉、皮疹、惡心嘔吐等不良反應(yīng)有所改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。此外，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，槐耳具有部分逆轉(zhuǎn)諸如乳腺癌、肺癌、肝癌等癌癥多藥耐藥的功效[9-11]。然而，槐耳顆粒是否能夠逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)Sorafenib的獲得性耐藥，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過(guò)初步探究槐耳顆粒對(duì)Sorafenib耐藥肝癌細(xì)胞BEL-7402/S的影響，為槐耳顆粒的臨床使用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞及藥物

BEL-7402細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；Sorafenib購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司(純度:99%)；槐耳顆粒購(gòu)于啟東蓋天力藥業(yè)有限公司。

1.2 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液(上海源培生物科技有限公司)、胎牛血清(Gibco公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)(上海源培生物科技有限公司)、0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(上海源培生物科技有限公司)、青霉素-鏈霉素雙抗(100×)(上海源培生物科技有限公司)、CCK-8(DOJINDO公司)、DMSO(BIOSHARP公司)、TRIzol?Reagent(Ambion公司)、5×All-In-One RT MasterMix(Abm公司)、EvaGreen 2× qRCR MasterMix(Abm公司)、RIPA裂解液(Beyotime公司)、ELC化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(通用型，50×)(Beyotime公司)、DEPC水(Beyotime公司)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)(Beyotime公司)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Beyotime公司)、HIF-1α抗體(Immunoway公司)、VEGF-A抗體(Immunoway公司)、β-actin抗體(Immunoway公司)、HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Immunoway公司)。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)(ESCO公司，型號(hào)：ACB-4A1)、常溫離心機(jī)(Eppendorf公司，型號(hào)：5702)、倒置顯微鏡(Leica公司，型號(hào)：090-135.001)、三洋二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司，型號(hào)：MCO-20AIC)、Infinite多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司，型號(hào)：M200 Pro)、梯度PCR儀(德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司，型號(hào)：Biometra Tone 96G)、定量PCR儀(Applied Biosystems By Life Technologies公司，型號(hào)：QuantStudio 7 Flex)、微孔板專用離心機(jī)(Eppendorf公司，型號(hào)：5430)、超聲波細(xì)胞裂解儀(Bandelin公司，型號(hào)：SONOPULS mini20)。高電流電泳儀電源(BIO-RAD公司，型號(hào)：PowerPacTMHC)、垂直電泳槽(上海天能科技有限公司，型號(hào)：VE-180)、蛋白印記-多功能成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司，型號(hào)：GelDoc 2000)。

2 方法

2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)

將肝癌細(xì)胞BEL-7402培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)Sorafenib對(duì)BEL-7402細(xì)胞的增殖-毒性作用

將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×104mL-1。用PBS填充96孔板四周的孔后，分別設(shè)置空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、Sorafenib各劑量組,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別向各孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，向空白對(duì)照組各孔中加入100 μL PBS。于培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。吸去96孔板中培養(yǎng)液后，向正常對(duì)照組各孔中加入100 μL培養(yǎng)液；向Sorafenib各劑量組的孔中加入100 μL不同濃度的Sorafenib藥液。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸去各孔中的溶液，向各組各孔中分別加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h左右。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的OD值，計(jì)算出Sorafenib對(duì)BEL-7402細(xì)胞生存率的影響以及相應(yīng)的IC50值。

2.3 肝癌Sorafenib耐藥細(xì)胞的建立

采用濃度梯度遞增法建立BEL-7402/S耐藥細(xì)胞株。以濃度為1 μmol/L的Sorafenib作為初始誘導(dǎo)濃度，逐步進(jìn)行濃度爬坡。每2～3周爬坡1次。每次爬坡的濃度約提高1.2～1.5倍左右。根據(jù)細(xì)胞的具體狀態(tài)調(diào)整合適的爬坡濃度，最終得到穩(wěn)定的能耐受4 μmol/L Sorafenib的BEL-7402/S耐藥細(xì)胞株。將耐藥細(xì)胞株置于含有0.2 μmol/L Sorafenib的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以維持其耐藥性。于實(shí)驗(yàn)前1周左右，將耐藥細(xì)胞恢復(fù)至正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 CCK-8法檢測(cè)槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用

實(shí)驗(yàn)方法同步驟2.2。以未加藥處理的BEL-7402/S細(xì)胞作為正常對(duì)照。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、不同濃度的槐耳顆粒劑量組。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的OD值，計(jì)算出槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞生存率的影響以及IC50值。

2.5 CCK-8法檢測(cè)槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞耐藥性的影響

采用非細(xì)胞毒性劑量的槐耳顆粒來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)Sorafenib的耐藥實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法同步驟2.2。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、Sorafenib組、槐耳顆粒+Sorafenib組。通過(guò)測(cè)定各孔OD值計(jì)算出各組別的IC50值以及槐耳顆粒的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC50(Sorafenib組)/IC50(槐耳顆粒+Sorafenib組)。

2.6 qPCR法檢測(cè)槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA水平的影響

使用6孔板接種適量BEL-7402/S細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，在對(duì)照組中加入Sorafenib藥液，在實(shí)驗(yàn)組中加入1 mg/mL槐耳顆粒與Sorafenib藥液。48 h后，使用TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞的總RNA，并用DEPC水稀釋至同一濃度。按照5×All-In-One RT MasterMix試劑盒的要求配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，使用梯度PCR儀設(shè)置相應(yīng)程序，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作。具體程序如下：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。將RNA逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA放置于冰上，按照EvaGreen 2×qRCR MasterMix試劑盒的要求配制qPCR反應(yīng)體系。引物序列如表1所示。通過(guò)2-△△Ct計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于正常對(duì)照組目的基因的變化倍數(shù)。

表1 各基因引物序列與長(zhǎng)度

2.7 Western blot法檢測(cè)槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白水平的影響

細(xì)胞分組、培養(yǎng)、給藥同步驟2.6。在給藥48 h后，使用加入了蛋白酶抑制劑的PIPA裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎得到蛋白液。通過(guò)BCA定量法測(cè)定蛋白液的濃度，將不同組別樣品用PIPA裂解液平衡至同一濃度。加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻后置于干式恒溫器中變性。在配制好蛋白凝膠后，將各組樣品上樣。通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色的步驟進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Sorafenib對(duì)BEL-7402細(xì)胞的增殖-毒性作用

結(jié)果如圖1所示，使用不同濃度的Sorafenib處理BEL-7402細(xì)胞48 h后，均對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。使用SPSS軟件回歸分析中的Probit分析，在置信限度中估算出Sorafenib對(duì)BEL-7402細(xì)胞的增殖-毒性作用的IC50值為10.620 μmol/L。

3.2 槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用

結(jié)果如圖2所示，使用不同濃度的槐耳顆粒處理BEL-7402/S細(xì)胞48 h后，均對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。與對(duì)照組相比，當(dāng)濃度達(dá)到8 mg/mL及以上時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生了顯著性抑制作用(P<0.05)。使用SPSS軟件估算出槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用的IC50值為10.117 mg/mL。

3.3 槐耳顆粒逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)Sorafenib耐藥的作用

選擇濃度為1 mg/mL的非毒性劑量(抑制率<5%)的槐耳顆粒來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)Sorafenib的耐藥實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，槐耳顆?？梢栽黾覤EL-7402/S細(xì)胞對(duì)Sorafenib的敏感性，降低IC50值，提高Sorafenib對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞的抑制作用，其耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.08。

3.4 槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA水平的影響

結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，槐耳顆?？梢韵抡{(diào)BEL-7402/S細(xì)胞中HIF-1α的mRNA水平(P<0.05)，但對(duì)VEGF的mRNA水平無(wú)顯著性影響。

3.5 槐耳顆粒對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，槐耳顆?？梢韵抡{(diào)HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，從而緩解并部分逆轉(zhuǎn)了BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)Sorafenib的耐藥現(xiàn)象。

4 討論

中藥槐耳是一種寄生于槐木上的木耳，為多孔菌科真菌槐栓菌TrametesrobiniophilaMurr.的子實(shí)體，又稱為槐檽、槐菌、槐雞、槐鵝、赤雞等，廣泛分布于河北、陜西、山東、四川、重慶等地區(qū)?；倍云?、味苦辛，無(wú)毒，具有抗腫瘤、止血、免疫調(diào)節(jié)等功效。近年來(lái)，槐耳主要被應(yīng)用于腫瘤治療相關(guān)領(lǐng)域，并且取得了巨大成功。醫(yī)學(xué)界及科研學(xué)術(shù)界對(duì)槐耳進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)槐耳可以對(duì)抗多種癌癥，其內(nèi)容涉及抑制腫瘤細(xì)胞增殖[12-14]、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[15-16]、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[17-19]、增加放療及化療敏感性[20-21]等多個(gè)方面。

槐耳顆粒是由藥用真菌槐耳經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)工藝加工而成的顆粒劑，常用于原發(fā)性肝癌、肺癌、乳腺癌、腸癌的輔助治療。在標(biāo)準(zhǔn)化療藥抗癌的基礎(chǔ)上，槐耳顆?？梢赃M(jìn)一步提高抗癌療效，延長(zhǎng)患者生存期并改善患者生活質(zhì)量。2018年發(fā)表在權(quán)威雜志Gut上的文章指出，槐耳顆粒可以使肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率顯著降低，生存期顯著延長(zhǎng)[22]。除了具有直接的抗癌作用外，槐耳顆粒逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的功效同樣值得關(guān)注。已有大量研究指出，槐耳顆?？梢阅孓D(zhuǎn)多種腫瘤耐藥細(xì)胞株的耐藥現(xiàn)象，其中包括逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7/ADM對(duì)阿霉素的耐藥[9]，人肺腺癌細(xì)胞株A2/cDDP對(duì)順鉑的耐藥[10]，人肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑[23]以及氟尿嘧啶的耐藥[7]等。這說(shuō)明槐耳顆?？赡苁怯行孓D(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的藥物。

腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥等方面密切相關(guān)。已有研究指出，通常在Sorafenib耐藥的肝癌細(xì)胞及組織中，缺氧微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致HIF-1α呈現(xiàn)高表達(dá)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)HIF-1α下游因子VEGF的表達(dá)，而抑制HIF-1α的表達(dá)則可以緩解肝癌細(xì)胞對(duì)Sorafenib的耐藥[24-26]。

綜上所述，課題組建立起了對(duì)Sorafenib耐藥的肝癌細(xì)胞株BEL-7402/S，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究初步證明非細(xì)胞毒性劑量的槐耳顆?？梢栽黾覤EL-7402/S細(xì)胞對(duì)Sorafenib的敏感性并部分逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象，提高Sorafenib對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，且相關(guān)的機(jī)制可能與抑制HIF-1α及VEGF的表達(dá)有關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還將進(jìn)一步對(duì)槐耳顆粒抑制Sorafenib耐藥的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入的探究和確證。