紫草素對(duì)乙酰膽堿-氯化鈣混合液誘導(dǎo)的房顫大鼠的保護(hù)作用研究

王鑰，陳斌，盧悟廣，蔡蕊，徐留剛，黃丹，曹鵬,3，沈建平，周謙

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

心房顫動(dòng)(Atrial fibrillation，AF)是中老年人群最常見的心律失常，與血栓栓塞、心力衰竭和認(rèn)知功能受損的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)[1]。隨著人口老齡化，房顫可能成為更大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[2]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，房顫是多種發(fā)病機(jī)制共同作用的結(jié)果，包括自主神經(jīng)機(jī)制、心房電重構(gòu)、心房組織重構(gòu)、炎癥學(xué)說、分子遺傳機(jī)制等[3]。其中炎癥和房顫的關(guān)系密切，研究指出，局部或全身炎癥導(dǎo)致房顫，房顫又將促進(jìn)炎癥發(fā)展。此外，與竇性心律患者相比，房顫患者的血清炎癥標(biāo)志物水平較高,炎癥還會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，觸發(fā)房顫[4]?，F(xiàn)階段房顫的治療主要分為藥物治療和射頻消融手術(shù)治療。傳統(tǒng)的抗房顫藥物若使用不當(dāng)可能造成藥物性心律失常，還會(huì)造成副作用，如傳統(tǒng)抗心律失常藥物胺碘酮在實(shí)際臨床應(yīng)用中受到心臟外副作用的限制，尤其是甲狀腺、肺和眼睛的毒性[5]。心律失常抑制試驗(yàn)(CAST)和口服D-索他洛爾(SWORD)生存的臨床結(jié)果促使研究人員關(guān)注抗心律失常藥物的安全性。較藥物治療，心房顫動(dòng)的心律失常源在手術(shù)策略中被消融破壞，但其應(yīng)用受到成本高、過程復(fù)雜、患者依從性不全、復(fù)發(fā)率高的限制，因此，目前可用的治療方法療效有限，需要開發(fā)新的房顫藥物[6]。

紫草素(Shikonin)是傳統(tǒng)中藥紫草提取的一種萘醌類化合物，已被證實(shí)具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、傷口愈合、抗血栓等多種生物學(xué)作用[7]。積累的文獻(xiàn)報(bào)道紫草素對(duì)心血管具有一定保護(hù)作用：紫草素可以通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞免受缺氧/再氧化缺血再灌注損傷[8]。紫草素可以通過抑制纖維化、炎癥、凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑保護(hù)異丙腎上腺素誘發(fā)的小鼠心衰[9]。此外，紫草素還可以對(duì)血管內(nèi)皮起保護(hù)作用[10]。但是，紫草素對(duì)陣發(fā)性房顫的作用及可能機(jī)制尚未見研究報(bào)道。本研究目的在于探索紫草素保護(hù)Ach-CaCl2誘導(dǎo)的房顫大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

紫草素化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1(純度>98%，批號(hào)：SLBT9802，SIGMA-ALDRICH公司)；二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：BCBW5664，SIGMA-ALDRICH公司)；多聚甲醛(純度≥95%，批號(hào)：20161012)購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙酰膽堿與氯化鈣(批號(hào)：A6625 MSDS、449709 MSDS，SIGMA-ALDRICH公司)；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(批號(hào)：PI328、PT520，碧云天公司)；TNF-α、IL-6抗體(批號(hào)：A0277，A11115，ABclonal公司)。

電子心電圖機(jī)(BL-420生物機(jī)能系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司)；便攜式超聲機(jī)(Vivid q，GE Medical Systems Israel Ltd_4)，顯微鏡(FEI Apreo)，冰凍切片機(jī)(LEICA CM1950)，Western blot電泳儀(Mini Protean 3 Cell，BIORAD)，轉(zhuǎn)膜儀(P.O. Box 13210 Minneapolis,MN 55414，Idea Scientific Company)。

1.2 動(dòng)物

雄性SD大鼠,8周齡，體質(zhì)量(250±25)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：SCXK(滬)2013-0016。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度為23～25 ℃，濕度40%～70%，動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)過程符合《江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物道德倫理的相關(guān)規(guī)定(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查表編號(hào)：AEWC20181221-63)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠分為3組，正常對(duì)照組15只，模型組15只，紫草素組15只。模型組：每100 g尾靜脈注射混合藥液0.1 mL(內(nèi)含Ach 33 μg/mL，CaCl25 mg/mL)，每日1次,連續(xù)7 d；紫草素組：提前1周灌胃給藥，之后連續(xù)7 d每100 g尾靜脈注射混合藥液0.1 mL(內(nèi)含Ach 33 μg/mL，CaCl25 mg/mL)，紫草素濃度為4 mg/(kg·d)(溶于0.2%DMSO)；正常對(duì)照組：提前1周每300 g灌胃生理鹽水1 mL/d，然后每100 g尾靜脈注射生理鹽水0.1 mL，每日1次，共注射7 d。給藥結(jié)束后取樣。

1.4 心電圖及超聲數(shù)據(jù)收集

采用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，采用電子心電圖機(jī)對(duì)大鼠進(jìn)行肢體導(dǎo)聯(lián)，在尾靜脈注射Ach-CaCl2混合液的同時(shí)記錄心電圖，給藥后大鼠被誘發(fā)了陣發(fā)性房顫，待陣發(fā)性房顫自行恢復(fù)至正常心律后停止記錄。記錄完心電圖后將大鼠胸腹部剔除毛發(fā)，采用便攜式彩色超聲多普勒診斷儀進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。以二維超聲模式截取大鼠心臟的動(dòng)圖，測(cè)量大鼠的左心房?jī)?nèi)徑(LAD)、描記左心房面積(LA area)來評(píng)估左心房重構(gòu)情況；M型超聲測(cè)量左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDS)，左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)。

1.5 Masson染色法

取各組心房肌組織，用4%多聚甲酸固定，經(jīng)梯度脫水、浸蠟包埋、切片貼片、常規(guī)脫蠟后行Masson染色，觀察心房肌組織膠原纖維的增生情況。

1.6 電鏡檢測(cè)

每組取3只心臟，將心房與心室分離，心房置入電鏡液里儲(chǔ)存進(jìn)行充分前固定，經(jīng)PBS清洗后，用1%鋨酸固定，再用PBS充分清洗，利用丙酮進(jìn)行梯度脫水，經(jīng)環(huán)氧樹脂混合物包埋后制備心肌超薄切片，再在透射電鏡下進(jìn)行觀察并拍攝圖片，觀察心房肌超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.7 生化指標(biāo)檢測(cè)

采用腹主動(dòng)脈取血的方式進(jìn)行取血，收集房顫大鼠腹主動(dòng)脈血，通過離心機(jī)(2 000 r/min，30 min)分離出血清，ELISA法測(cè)定血清腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平。

1.8 Western blot檢測(cè)

每組取5只心房組織，采用液氮研磨的方式提取蛋白，Western blot法檢測(cè)IL-6、TNF-α炎癥指標(biāo)蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)房顫大鼠心電圖的影響

大鼠房顫心電圖標(biāo)準(zhǔn)為：①P波消失代之以不規(guī)則的f波；②R-R間期絕對(duì)不等(此外，一旦出現(xiàn)心房撲動(dòng)的情況，也納入心房顫動(dòng)的范圍)。在確定心房顫動(dòng)是否發(fā)生后，再進(jìn)一步計(jì)算心房顫動(dòng)的持續(xù)時(shí)間與誘發(fā)時(shí)間。圖2為3組的心電圖比較，正常對(duì)照組為正常心電圖，P波未消失，心律正常；模型組P波消失代之以不規(guī)則的小f波，心律不齊；紫草素組為房撲心電圖。柱狀圖為房顫誘發(fā)時(shí)間，正常對(duì)照組沒有房顫發(fā)生，模型組與紫草素組比較(P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明紫草素組明顯地延長(zhǎng)了房顫誘發(fā)時(shí)間，改善了大鼠心電圖。

2.2 紫草素改善房顫大鼠的心房重構(gòu)

對(duì)3組大鼠進(jìn)行了超聲心動(dòng)圖的檢查，結(jié)果提示模型組LAD、LA area的值均較正常對(duì)照組增大，考慮大鼠造模成功后出現(xiàn)了心房的重構(gòu)。圖3為正常對(duì)照組與模型組及紫草素組的超聲心動(dòng)圖，上半部分為二維超聲圖，下半部分為M型超聲圖。

2.3 紫草素對(duì)房顫大鼠組織形態(tài)的影響

2.3.1 大鼠心房組織Masson染色結(jié)果 如圖4空白對(duì)照組心房肌組織正常，排列整齊，間隙均勻僅有少量膠原纖維；模型組心肌纖維紊亂，膠原纖維較多，且有明顯的心肌損傷，紫草素組僅在血管周圍有少量纖維，心肌排列稍有紊亂。

2.3.2 大鼠心房組織透射電鏡結(jié)果 如圖5所示，空白組大鼠心肌肌絲及線粒體超微結(jié)構(gòu)并無明顯異常，肌絲排列整齊、明帶暗帶清晰可辨，肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常；線粒體在肌絲之間密集的平行排布，形狀規(guī)則，大小正常，嵴豐富。模型組肌絲分布不均勻，線粒體排列不規(guī)則，肌絲發(fā)生斷裂，溶解現(xiàn)象；從5 000倍的圖可以比較出模型組線粒體大小較空白組體積增大，線粒體大小不一，且線粒體腫脹嵴減少。紫草素組心肌肌絲稍有紊亂，線粒體腫脹嵴減少，較模型組有所減輕。

2.4 ELISA法測(cè)定血清中TNF-α、IL-6水平

與空白對(duì)照組比較，模型組的TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較，紫草素給藥后明顯降低(P<0.01)。結(jié)果見圖6。

2.5 Western blot法檢測(cè)IL-6、TNF-α炎癥指標(biāo)蛋白的表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組炎癥因子蛋白表達(dá)增多(P<0.05～0.01)，紫草素組較模型組降低了炎癥因子蛋白的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見圖7。

3 討論

我們的研究首次表明，紫草素可以抑制Ach-CaCl2混合液誘導(dǎo)的大鼠陣發(fā)性房顫的發(fā)生發(fā)展。此次我們通過Ach-CaCl2混合液來誘導(dǎo)大鼠的陣發(fā)性房顫，Ach和Ca2+在心房心電重構(gòu)過程中起重要作用。Ach作用于心房肌膽堿能M2受體，激活受體依賴K+通道，K+外流增加，使心房肌細(xì)胞復(fù)極加快，動(dòng)作電位及有效不應(yīng)期縮短。心電圖顯示紫草素縮短了大鼠陣發(fā)性房顫的誘導(dǎo)時(shí)間。我們通過心臟超聲發(fā)現(xiàn)紫草素改善了心房擴(kuò)大的情況，研究發(fā)現(xiàn)左心房擴(kuò)大與房顫有關(guān)，既是房顫的原因，也是房顫的結(jié)果[11]。另研究表明，單純性房顫病人與正常竇性心律的人相比，會(huì)出現(xiàn)明顯的膠原沉積[12]；控制心室率不變，快速起搏心房，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)積累明顯增加，表明房顫本身可以促進(jìn)心房纖維化[13]；通過觀察Masson染色的結(jié)果，紫草素也改善了心房肌膠原纖維的積累。以上研究提示紫草素改善了房顫的發(fā)生發(fā)展，對(duì)大鼠房顫具有保護(hù)作用。

另外發(fā)現(xiàn)紫草素影響了房顫大鼠的炎癥因子表達(dá)，而炎癥被認(rèn)為與促進(jìn)AF底物形成的各種病理過程有關(guān)，如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和纖維化[14]。房顫患者炎癥標(biāo)志物的濃度顯著升高，并支持房顫與炎癥之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，IL-6由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并刺激炎癥反應(yīng)，分析報(bào)告顯示，在一般人群中，IL-6水平越高，AF風(fēng)險(xiǎn)越大。血清IL-6水平升高也與心電和導(dǎo)管消融后房顫復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[15]。Conway等證明高血清IL-6水平與卒中或死亡的復(fù)合終點(diǎn)獨(dú)立相關(guān)[16]。TNF-α由各種免疫細(xì)胞合成，包括巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，TNF-α刺激急性免疫細(xì)胞反應(yīng)，誘發(fā)炎癥。Wu等表明血清TNF-α水平越高，房顫風(fēng)險(xiǎn)越大[15]。Li等采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，表明AF患者的炎癥生物標(biāo)志物TNF-α顯著增加，炎癥與心律失常之間的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)[17]。我們發(fā)現(xiàn)紫草素顯著抑制了房顫大鼠血清中IL-6與TNF-α的水平，并且保護(hù)了心臟組織。Yang等發(fā)現(xiàn)紫草素能夠顯著減少IL-6、TNF-α、NO在巨噬細(xì)胞RAW264.7中的含量，認(rèn)為紫草素是通過降低巨噬細(xì)胞中高遷移率族蛋白(HMGB)的表達(dá)，發(fā)揮其抗炎活性[18]。近年，紫草素抗炎作用機(jī)制的研究多與NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、IL-22等有關(guān)[19]。本次實(shí)驗(yàn)初步證明紫草素具有抑制房顫大鼠炎癥的作用，其保護(hù)房顫大鼠的機(jī)制仍需繼續(xù)深入的研究。

隨著人口老齡化的進(jìn)程，我國房顫的發(fā)生逐年增加，也加重了公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。紫草素作為傳統(tǒng)中藥紫草的提取物，具有豐富的藥理特性，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了紫草素對(duì)于大鼠陣發(fā)性房顫的治療效果，為尋找房顫新藥物提供了思路，為進(jìn)一步研究紫草素對(duì)房顫的作用及其作用機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。