基于缺氧組織中NLRP3炎癥小體的活化研究膝痹寧減輕KOA滑膜炎癥的效應(yīng)機(jī)制

張力，張立，邢潤(rùn)麟，黃正泉，李曉辰，徐波，肖延成，茆軍，王培民

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是臨床常見(jiàn)的退行性病變之一，其病理機(jī)制十分復(fù)雜，滑膜炎癥作為KOA的啟動(dòng)因素，貫穿全程并推動(dòng)KOA的病程進(jìn)展[1]。低氧狀態(tài)持續(xù)存在于KOA的病理過(guò)程中并促進(jìn)缺氧轉(zhuǎn)錄因子(HIF-1α)的表達(dá)[2]。既往的研究表明，HIF-1α誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的活化[3]。本研究團(tuán)隊(duì)在KOA成纖維樣滑膜細(xì)胞中找到了NLRP1和NLRP3炎癥小體介導(dǎo)滑膜炎癥的證據(jù)[4]，并證實(shí)了KOA滑膜組織的缺氧狀態(tài)伴隨著HIF-1α的表達(dá)上調(diào)，激活NLRP3炎癥小體加重KOA滑膜纖維化[5]。

大量研究證實(shí)了活血類(lèi)中藥或復(fù)方能有效降低組織中HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)[6-7]。膝痹寧(專(zhuān)利號(hào)：CN201010514325)是王培民教授針對(duì)KOA臨床診療以溫經(jīng)活血立法研發(fā)的中藥復(fù)方，長(zhǎng)期臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn),膝痹寧能有效緩解KOA疼痛、消除腫脹?；A(chǔ)研究也證實(shí)了膝痹寧可以有效降低KOA動(dòng)物血清中IL-1、IL-6、NO的含量[8]。

由此可見(jiàn)，膝痹寧治療KOA滑膜炎癥的效應(yīng)特點(diǎn)，與HIF-1α介導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化影響滑膜炎癥的病理機(jī)制十分契合，本次研究基于上述機(jī)理對(duì)膝痹寧的療效機(jī)制展開(kāi)探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取3月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠，24只，體質(zhì)量280～320 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，控制動(dòng)物房室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，12 h的光/暗方案。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)并在國(guó)家衛(wèi)生研究所關(guān)于保護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的方針指導(dǎo)下進(jìn)行的。

1.2 試劑與儀器

HIF-1α抗體(批號(hào)：ab179483，美國(guó)Abcam公司)、Caspase-1 p10抗體(批號(hào)：ab179515，美國(guó)Abcam公司)、NLRP3抗體(批號(hào)：ab214185，美國(guó)Abcam公司)、GSDMD抗體(批號(hào)：ab219800，美國(guó)Abcam公司)、GAPDH抗體(批號(hào)：ab3243，美國(guó)Abcam公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：RR036A、RR820A，日本Takara公司)，HypoxyprobeTM-1 Plus Kit(批號(hào)：HP2-100Kit，美國(guó)Hypoxyprobe公司)，IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(批號(hào)：ab100767、ab213909，美國(guó)Abcam公司)。

BioPhotometer plus核酸蛋白檢測(cè)儀(德國(guó)Eppendorf公司)，Mastercycler nexus逆轉(zhuǎn)錄PCR儀(德國(guó)Effendorf Minispin公司)，7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，Carl Zeiss LSM710共焦激光掃描顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及建模 由SPSS軟件生成隨機(jī)數(shù)，隨機(jī)均分為3組：空白組、KOA組、膝痹寧組，每組8只。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，KOA組、膝痹寧組大鼠3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮，常規(guī)75%酒精消毒。膝關(guān)節(jié)屈曲45°，1 mL注射器自髕骨下髕腱最外側(cè)進(jìn)針，抵股骨髁后退針2 mm，注射2%碘乙酸鈉50 μL。雙膝關(guān)節(jié)依次注射，完成后大鼠回籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)，關(guān)節(jié)不固定，14 d后KOA模型構(gòu)建成功。空白組大鼠關(guān)節(jié)腔注射50 μL高溫消毒的生理鹽水作為對(duì)照。

1.3.2 膝痹寧藥液的制備及藥物干預(yù) 依據(jù)膝痹寧方臨床使用劑量：附片15 g,制狗脊15 g,紫河車(chē)10 g,山萸肉15 g,川桂枝15 g,巴戟天10 g,生薏以仁10 g,制首烏10 g,川牛膝10 g,生甘草5 g。所需藥材均購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，混合后蒸餾水浸泡過(guò)夜。煎煮配合旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液至1 mL相當(dāng)于原生藥1 g，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

KOA模型建立后，按臨床人體劑量的6.25倍計(jì)算每日大鼠灌胃量(1.04 mL/100 g)[8-9]，空白組和KOA組予相應(yīng)體積消毒生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。藥物干預(yù)當(dāng)天記為d1，d56結(jié)束干預(yù)。

1.3.3 滑膜組織提取 d56二氧化碳窒息處死大鼠，提取各大鼠滑膜組織。雙膝關(guān)節(jié)備皮，沿髕韌帶兩側(cè)做縱向切口。貼髕骨上緣，股四頭肌遠(yuǎn)端做橫切口，深及股骨。牽起髕骨及周?chē)M織，翻開(kāi)暴露淡黃透亮的薄膜組織，即為滑膜，手術(shù)刀片小心切取。每組隨機(jī)挑選2只大鼠，在處死前45 min，按60 mg/kg的劑量關(guān)節(jié)腔注射低氧探針，處死后取滑膜組織放入4%多聚甲醛固定。

1.3.4 HE及缺氧探針免疫熒光染色 常規(guī)石蠟包埋、切片、梯度脫水，HE染色試劑盒染色后觀察攝片。依據(jù)HypoxyprobeTM-1 Plus Kit試劑盒說(shuō)明，在常規(guī)蠟塊制作完成之后，一抗FITC-MAb1(1∶100)孵育60 min，PBS清洗后二抗anti-FITC(1∶100)孵育60 min，常規(guī)DAPI復(fù)染、封片，熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.5 qPCR檢測(cè)滑膜組織中HIF-1α、Caspase-1、NLRP3、GSDMD mRNA表達(dá) 嚴(yán)格按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)，在無(wú)RNA酶環(huán)境下提取滑膜組織總RNA。分光光度計(jì)測(cè)定RNA的水平，以A260/A280的OD值評(píng)價(jià)RNA純度，提取的總RNA按Prime Script RT reagent Kit 10 μL反應(yīng)體系，DEPC水補(bǔ)齊至10 μL。混勻離心后PCR儀中按37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄。檢索GenBank中相應(yīng)的基因序列，采用Oligo v6.6軟件設(shè)計(jì)引物，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司幫助合成。目的基因及內(nèi)參基因GAPDH序列見(jiàn)表1。

1.3.6 Western blot檢測(cè)滑膜組織中HIF-1α、Caspase-1 p10、NLRP3、GSDMD的蛋白表達(dá) 組織稱(chēng)質(zhì)量后勻漿，BCA試劑盒測(cè)定蛋白水平并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白煮沸變性后加樣電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉，1∶1 000加入一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗膜后，1∶1 000加入二抗室溫孵育，顯色液曝光。結(jié)果根據(jù)GAPDH內(nèi)參半定量計(jì)算用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7 ELISA法檢測(cè)滑膜組織中IL-1β、IL-18的水平 組織樣本稱(chēng)質(zhì)量后PBS中4 ℃勻漿，離心取上清，BCA試劑盒校正蛋白水平。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)辉O(shè)置5復(fù)孔，依次加樣(每孔100 μL)，孔板覆膜孵育；隨后棄上清依次換用抗體工作液、酶結(jié)合液覆膜孵育；最后加入顯色液，避光孵育后加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。

2 結(jié)果

2.1 膝痹寧對(duì)KOA大鼠滑膜炎癥的影響

HE染色觀察各組大鼠滑膜組織炎癥，結(jié)果顯示，KOA組滑膜組織較空白組表現(xiàn)出更多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，襯里層細(xì)胞排列紊亂；膝痹寧組較KOA組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。膝痹寧可抑制KOA大鼠滑膜炎癥，見(jiàn)圖1。

2.2 膝痹寧對(duì)KOA大鼠滑膜組織缺氧狀況的影響

Hypoxyprobe缺氧探針對(duì)各組大鼠的滑膜組織進(jìn)行哌莫硝唑染色顯示，KOA組較空白組缺氧程度加重，膝痹寧組大鼠的缺氧程度較KOA組減輕。膝痹寧可改善KOA大鼠滑膜組織的缺氧狀況，見(jiàn)圖2。

2.3 膝痹寧對(duì)KOA大鼠滑膜組織HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)的影響

如圖3～4所示，KOA組HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)均較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，膝痹寧可顯著降低KOA大鼠滑膜組織HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.01)。

2.4 膝痹寧對(duì)KOA大鼠滑膜組織中NLRP3炎癥小體活化的影響

如圖5～6所示，KOA組Caspase-1 p10、NLRP3、GSDMD的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于空白組(P<0.05～0.01)，而膝痹寧組較KOA組有所降低(P<0.05～0.01)。ELISA檢測(cè)各組滑膜組織中NLRP3炎癥小體活化下游IL-1β、IL-18的水平，2者在KOA組的含量均高于空白組(P<0.01)，而膝痹寧組較KOA組有所降低(P<0.01)，見(jiàn)圖7。

3 討論

慢性低度炎癥與組織氧化還原水平一直是研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。在KOA研究領(lǐng)域，大量的研究支持HIF-1α對(duì)于軟骨細(xì)胞存在保護(hù)作用，升高的HIF-1α可以提高軟骨細(xì)胞內(nèi)膠原合成酶的基因表達(dá)，促進(jìn)膠原合成[10]；也可以減少軟骨細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡[11]。在滑膜組織中，HIF-1α的升高誘導(dǎo)VEGF、TGF的表達(dá)，增加膠原沉積從而促進(jìn)了組織纖維化，這一發(fā)現(xiàn)與HIF-1α對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用十分契合[12]。HIF-1α引起NLRP3炎癥小體的活化參與多種疾病的病理過(guò)程，例如學(xué)者們?cè)诼宰枞苑渭膊〉幕颊哐逯邪l(fā)現(xiàn)了HIF-1α與NLRP3炎癥小體的高度相關(guān)性[13]，HIF-1α參與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧過(guò)程中NLRP3炎癥小體的激活等[14]。

本次研究表明，膝痹寧能減輕KOA滑膜炎癥，有效改善KOA滑膜組織缺氧狀況，降低HIF-1α的表達(dá)，減少NLRP3炎癥小體的活化，減輕滑膜炎癥。本次研究尚有些許不足，盡管實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞焦亡核心執(zhí)行蛋白GSDMD表達(dá)的異常，但對(duì)KOA中細(xì)胞焦亡的觀察還需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，這將是本研究團(tuán)隊(duì)努力的方向。