間充質(zhì)干細胞源性外泌體對前部缺血性視神經(jīng)病變患者的治療潛力△

李東麗 宮媛媛

基于不同細胞來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用已成為其治療包括心肌缺血、缺血性腦卒中等在內(nèi)各種組織來源的缺血性疾病最有前景的策略[1-3]。目前正在針對越來越廣泛的疾病適應(yīng)證進行各種動物模型研究和臨床試驗，而其衍生的外泌體(exosomes)因含蛋白因子、脂質(zhì)體、RNA、DNA 片段等傳遞細胞間信號作用和特有的一些優(yōu)勢，從而成為再生醫(yī)學的研究熱點;需要特別提出的是，根據(jù)細胞類型、細胞大小、細胞所處微環(huán)境變化，外泌體的內(nèi)容物成分呈差異性表達。研究證實，神經(jīng)細胞及干細胞分泌的外泌體在神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展進程及損傷

修復(fù)機制中起重要的調(diào)控作用[4]。因此，MSCs衍生的外泌體可能提供治療前部缺血性視神經(jīng)病變(anterior ischemic optic neuropathy，AION)和潛在的其他視網(wǎng)膜血管相關(guān)疾病新的安全的有效工具。

1 AION概述

AION是50歲以上患者最常見的由于后睫狀動脈循環(huán)障礙造成視盤供血不足，引起視神經(jīng)急性缺氧而水腫的一種病變，由于對本病的發(fā)病機制認識不充分，臨床上尚缺乏療效確切的治療方案[5]。非動脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變(non arteritic anterior ischemic optic neuropathy，NAION)是缺血性視神經(jīng)病變的最常見形式，故以下探討的AION均指非動脈炎性。研究顯示，這種形式的病變與各種危險因素有關(guān)，包括高齡、系統(tǒng)性高血壓、夜間低血壓、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停、高脂血癥等，血管活性藥物的使用可能是NAION的另一個風險因素，盡管已經(jīng)報道了許多血管活性藥物與NAION的關(guān)聯(lián)，但沒有一個被證明是最終明確的因果關(guān)系，對其發(fā)病機制也知之甚少[6]。

NAION可被稱為類似發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)中的腦卒中，其通常導(dǎo)致嚴重的視力喪失，可單側(cè)或雙側(cè)，患者通常表現(xiàn)出與視野缺損相關(guān)的急性、無痛性的視力喪失、相對傳入性瞳孔障礙、視盤腫脹和一個或多個火焰形狀的視盤周圍視網(wǎng)膜少量出血。視力喪失在首次發(fā)生后2個月內(nèi)通常保持穩(wěn)定，之后逐漸發(fā)展為彌漫性或節(jié)段性視盤蒼白，伴繼發(fā)性萎縮。研究顯示，對側(cè)眼隨訪5 a內(nèi)的NAION發(fā)生率為14.7%，第二眼受累的風險多為更差的基線視力或糖尿病等。NAION的組織病理學涉及缺血性水腫、海綿狀變性、視神經(jīng)軸突萎縮以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡[7]。藥物治療包括抗凝血藥物、抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物、皮質(zhì)類固醇和促紅細胞生成素等，但均未確切地被證明是持續(xù)有益的[8-9]。通過口服、靜脈內(nèi)、玻璃體內(nèi)或眼球下Tenons途徑給予類固醇的長期療效仍不確定[10]；有證據(jù)表明，視神經(jīng)開窗手術(shù)無效并且可能有害[11]。因此,迫切需要尋找有效的治療策略。干細胞療法可以進行組織再生，目標是恢復(fù)或替換受損的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)和缺氧損傷中受損和(或)退化的神經(jīng)元。目前已經(jīng)探索了不同來源的間充質(zhì)干細胞及其衍生的外泌體作為潛在治療工具。

2 間充質(zhì)干細胞源性外泌體的發(fā)生及其生物作用

MSCs為一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細胞亞組，在修復(fù)組織損傷、抑制局部炎癥和免疫調(diào)節(jié)中的治療潛力和安全性已得到眾多研究的支持。然而，使用MSCs有一些缺點，如需要具有穩(wěn)定的表型，成本高和生產(chǎn)儲存時間延遲等。此外，已經(jīng)報道了其在異位組織形成、細胞排斥等中的一系列問題[12]。研究表明，MSCs可以通過直接分化和旁分泌機制將分子(如生長因子、細胞因子和細胞外微泡)分泌到周圍環(huán)境中實現(xiàn)治療效果；在這些旁分泌分子中，外泌體在疾病診斷和治療中顯示出重要功能[13-14]。外泌體是一種幾乎可由所有類型細胞分泌到胞外空間的具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)的納米級囊泡，含有其母體細胞多種特異的結(jié)構(gòu)成分及其特性。目前外泌體神經(jīng)相關(guān)研究的治療效果已廣泛歸因于其表面標志物、分子內(nèi)容物、低免疫原性、穿過血-腦脊液屏障的能力以及介導(dǎo)神經(jīng)再生的作用[15]。然而，與外泌體類似，間充質(zhì)干細胞源性外泌體(MSC-exosomes)也攜帶核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等復(fù)雜物質(zhì)。通過質(zhì)譜、抗體陣列和微陣列分析，已經(jīng)在MSC-exosomes的內(nèi)容物中鑒定了超過850種獨特的基因產(chǎn)物和多于150種miRNA[16]。這些外泌體蛋白質(zhì)和miRNA的功能是復(fù)雜的，并且涉及許多不同的生物化學和細胞過程，如通信、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和再生以及代謝。這種廣泛的生物活性分布賦予MSC-exosomes引發(fā)多種細胞反應(yīng)，并與許多細胞類型相互作用的潛力。

3 MSC-exosomes治療AION的作用機制

MSCs不僅具有多向分化潛能，并能分泌多種細胞因子促進血管形成，改善血流灌注和氧供，因此，MSCs一直是缺血性疾病血管再生治療的研究熱點。MSC-exosomes含有MSCs來源的細胞特異性蛋白質(zhì)和核酸，能夠部分模擬MSCs功能，且能透過血-腦脊液屏障，可替代MSCs治療缺血性疾病的再血管化治療。最近，MSC-exosomes也已經(jīng)在各種神經(jīng)和神經(jīng)退行性疾病的治療中顯示出令人鼓舞的治療功效，包括創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中和阿爾茨海默病等[17]。然而，在AION中，視網(wǎng)膜的特殊結(jié)構(gòu)提供了一個更方便的位置來研究MSC-exosomes的缺血后神經(jīng)修復(fù)功能和其在視網(wǎng)膜中的分布。MSC-exosomes成功地將營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)因子遞送至視網(wǎng)膜內(nèi)部，并有效促進受損RGCs的存活和神經(jīng)再生。外泌體在介導(dǎo)MSCs作為基質(zhì)支持細胞的功能中起關(guān)鍵作用，以維持組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)并響應(yīng)外部刺激。目前的各種臨床試驗證據(jù)顯示，基于細胞療法的MSCs不是替代受損細胞，而是通過向細胞內(nèi)遞送功能性蛋白質(zhì)分子和miRNA信號來促進神經(jīng)可塑性，促進血管生成，抑制氧化應(yīng)激和纖維化，減少細胞凋亡以及起到免疫調(diào)節(jié)作用，為眼部缺血性視神經(jīng)病變重塑建立適當?shù)奈h(huán)境，從而快速啟動細胞修復(fù)功能。以下綜述了MSC-exosomes在治療AION相關(guān)疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的主要作用機制，為該領(lǐng)域研究者進一步探索MSC-exosomes在AION的有效治療提供依據(jù)。

3.1 促進神經(jīng)可塑性視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜RGC軸突和支持神經(jīng)膠質(zhì)組成的CNS白質(zhì),這使它們?nèi)菀资艿絼?chuàng)傷性和退行性疾病。ahin等[18]通過光譜域光學相干斷層掃描(spectral domain optical coherence tomography,SD-OCT)檢測到慢性期NAION患者眼中黃斑神經(jīng)節(jié)細胞復(fù)合體和視盤周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度明顯變薄和軸突損傷。雖然手術(shù)或皮質(zhì)類固醇可能使一些患者受益，但由于進行性RGC軸突變性和壞死，失去的視力可能是永久性的。已證明基于細胞療法的MSCs促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性和神經(jīng)血管重塑導(dǎo)致功能獲益[19]。而MSCs通過其衍生的外泌體促進神經(jīng)血管重塑，改善神經(jīng)功能恢復(fù)，促進內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的發(fā)生。 Mead等[20]用大鼠視神經(jīng)擠壓模型模擬RGC凋亡和軸突變性，玻璃體內(nèi)骨髓MSC-exosomes注射后在OCT和視網(wǎng)膜電圖下顯示了RGC軸突的顯著保護(以視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度測量)和RGC功能的保留(以pSTR振幅測量)。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC-exosomes促進皮層神經(jīng)元的軸突生長，而攜帶升高的miR-17-92的MSC-exosomes進一步促進這種效應(yīng)。MSC-exosomes也報道了Akt途徑的激活，這是受損RGC存活和再生的主要途徑[20]?？傊瑪?shù)據(jù)表明MSC-exosomes含有多種miRNA，外泌體成功地將物質(zhì)運送到視網(wǎng)膜內(nèi)層以及Müller膠質(zhì)細胞和RGCs，并通過miRNA依賴性機制引發(fā)治療效果[20]。RGCs的喪失或功能障礙是不可逆性失明的主要原因，而外泌體可以將生物活性核酸遞送到視網(wǎng)膜內(nèi)多層的能力表明無細胞療法可能有益于缺血性或退行性神經(jīng)眼病的治療。

3.2 促進血管生成研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜視盤旁和脈絡(luò)膜血管密度在急性和慢性NAION患者中顯著減少。 Song等[22]用光學相干斷層掃描血管造影術(shù)(optical coherence tomography angiography,OCTA)檢測到NAION患者視網(wǎng)膜毛細血管周圍和視神經(jīng)盤的血管密度顯著低于正常組，證實了此類疾病中視網(wǎng)膜和視盤中的血液灌注不足和微血管的丟失。而缺血后損傷修復(fù)的關(guān)鍵因素之一就是血管新生。已經(jīng)證明MSCs 外泌體在心肌缺血/再灌注損傷、腦損傷模型中表現(xiàn)出血管保護作用[23-24]。MSC-exosomes被血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells,VEC)有效吸收,實驗顯示這些外泌體通過ERK/Akt信號刺激VEC遷移和血管形成[25]；全面蛋白質(zhì)組學分析顯示，MSC-exosomes表達涉及血管生成的多種因子，包括核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)相關(guān)的信號蛋白，而NF-κB信號傳導(dǎo)被鑒定其為誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)。對促血管生成因子進行分析，發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducing factor,EMMPRIN)的水平較高，敲除此基因后VEC 的促血管生成作用明顯減弱。因此，MSC-exosomes強大的促血管生成作用主要是通過外泌體的基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(matrix metalloproteinase inducing factor,MMPRIN) 實現(xiàn)的[26]。外泌體攜帶的miRNA 在MSCs介導(dǎo)的缺血后內(nèi)皮細胞功能修復(fù)和血管生成中也起重要調(diào)控作用，Saif 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-424 通過靶向cullin 2 促進血管新生。研究證明，接觸模擬缺血微環(huán)境可以提高一些促血管發(fā)生蛋白和功能性miRNA 在 MSCs及其外泌體中的表達，這些 MSCs及其外泌體含有強大的促血管再生成分，能夠誘導(dǎo)血管再生。Moisseiev等[28]研究結(jié)果顯示，玻璃體內(nèi)注射來自低氧條件下培養(yǎng)的人MSC-exosomes能顯著減少氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型中的視網(wǎng)膜缺血，并促進新生血管形成；Lv等[29]證實，在低氧條件下低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)過表達的MSCs 分泌外泌體增強血管生成和血管通透性?？偟膩碚f，MSC-exosomes或經(jīng)處理后含有較強大的血管生成旁分泌效應(yīng)物有望彌補MSCs的不足，成為治療AION及相關(guān)疾病的有效治療策略[30]。

3.3 抑制氧化應(yīng)激和減少細胞凋亡NAION患者由于短后睫狀動脈灌注減少引起視神經(jīng)損傷，之后導(dǎo)致RGCs的凋亡和視神經(jīng)萎縮[31]。Dreixler等[32]已經(jīng)確定，在具有急性缺血-再灌注損傷的動物眼中，玻璃體內(nèi)注射MSCs導(dǎo)致RGC層的保存，這種效果可以通過玻璃體內(nèi)注射條件培養(yǎng)基來復(fù)制，培養(yǎng)基通過減弱缺血后細胞凋亡和凋亡相關(guān)基因表達來預(yù)防缺血后視網(wǎng)膜細胞丟失。以往研究證明，靜脈注射MSCs通過抑制細胞凋亡和減少炎癥反應(yīng)來挽救視網(wǎng)膜激光損傷，但其較少遷移到受損的視網(wǎng)膜，推測主要是通過分泌營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)眼內(nèi)微環(huán)境在神經(jīng)保護中起作用。類似地，Yu等[33]進一步使用同樣激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷動物模型比較玻璃體內(nèi)注射MSC-exosomes和MSCs的效果，發(fā)現(xiàn)MSC-exosomes對受損視網(wǎng)膜的保護作用與抑制損傷、減少細胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的程度與MSCs相當，并表明MSC-exosomes部分通過下調(diào)MCP-1改善激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。此外，Xiao等[34]在大鼠氧-葡萄糖剝奪模型誘導(dǎo)的缺血缺氧性CNS少突膠質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)，骨髓MSCs衍生的miR-134外泌體通過負向調(diào)節(jié)caspase-8依賴性凋亡途徑抑制少突膠質(zhì)細胞的凋亡。因此，MSCs 衍生的外泌體部分地充當將miRNA轉(zhuǎn)移到遠端受體細胞的載體，改變其miRNA表達來介導(dǎo)受體細胞的抗凋亡功能。MSC-exosomes也能增強有益miRNA表達，刺激軸突向外生長，從而改善缺血后神經(jīng)的功能恢復(fù)。

3.4 免疫調(diào)節(jié)作用研究顯示，在NAION缺血性梗死后存在多核型白細胞的浸潤和巨噬細胞的吞噬和清除作用，揭示了細胞免疫反應(yīng)參與視神經(jīng)的損傷[35]。然而，早期NAION后炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致持續(xù)或甚至進行性視神經(jīng)功能障礙，如果發(fā)生后一種效應(yīng)，針對性地減少早期炎癥反應(yīng)可能引起NAION患者的視力改善。Doeppner等[36]發(fā)現(xiàn)MSC-exosomes在小鼠中風模型中改善神經(jīng)恢復(fù)，增加神經(jīng)發(fā)生和血管生成，并參與了缺血后免疫反應(yīng)。體內(nèi)研究表明，人臍帶MSCs外泌體可以通過下調(diào)炎性細胞因子如TNF-α、巨噬細胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)、IL-6和γ干擾素(interferon，IFN-γ)來改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)；有研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶MSC-exosomes通過減少眼內(nèi)T細胞亞群和其他炎癥細胞的浸潤，大大降低了正在進行的實驗性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎的強度，從而保護視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和挽救視網(wǎng)膜功能[25]。此外,MSC-exosomes也已經(jīng)在創(chuàng)傷性腦損傷模型中進行了測試，結(jié)果表明MSC-exosomes部分通過減少神經(jīng)炎癥來增強新生成的內(nèi)皮細胞和新形成的未成熟和成熟神經(jīng)元，從而改善創(chuàng)傷性腦損傷后的功能恢復(fù)[24]。鑒于外泌體被認為是含有大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA和RNA的復(fù)雜“活”結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能以多種方式協(xié)同作用。總之，NAION相關(guān)的炎癥問題與潛在治療有關(guān)，而MSC-exosomes不僅具有低免疫原性，而且能夠激活免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，傳遞miRNA至靶細胞從而維持組織穩(wěn)態(tài)，因此有望在缺血性視神經(jīng)病變中提供有益的治療效果。

4 結(jié)語

NAION是一種對患者視力具有破壞性結(jié)果的常見神經(jīng)眼科疾病，伴有病理生理學機制上的不明確，以及其他關(guān)于眼睛受累和治療策略有爭議的研究數(shù)據(jù)。盡管MSCs移植在再生醫(yī)學中具有巨大的應(yīng)用，但與活細胞相比，MSC-exosomes更穩(wěn)定，可保留，可避免異基因免疫排斥、不必要的分化和小血管阻塞等風險。MSC-exosomes與MSCs非常相似地通過各種作用機制保護視神經(jīng)和促進軸突再生，這在眼前部缺血性視神經(jīng)病變中是一種非常有吸引力的新型非細胞治療方法，值得進一步眼科學方面的的探索。此外，外泌體還可以作為載體提供具有現(xiàn)成遞送能力的更集中的促進組織愈合因子的來源。然而，需要在AION模型中進一步研究以確定是否可以觀察到這些外泌體的有益作用，在將該療法轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用之前，需要額外的長期安全性信息和劑量反應(yīng)評估。此外，高質(zhì)量高效率的分離提純技術(shù)和必須明確不同組織外泌體中各種生物活性物質(zhì)的確切機制及其生物學效應(yīng)的持續(xù)時間均仍是目前外泌體研究領(lǐng)域需要進一步深入探討的問題；仔細選擇最有效的組織源性外泌體和適合特定生物樣品的分離技術(shù)，最終可以滿足涉及外泌體診斷和治療的臨床應(yīng)用的需求。