循環(huán)腫瘤DNA檢測應(yīng)用于非小細胞肺癌的研究進展

劉萬立，洪瓊川

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東 珠海 519000； 2.深圳市龍崗中心醫(yī)院心胸外科，廣東 深圳 518116)

肺癌在我國癌癥中的發(fā)病率和病死率均居首位，每年肺癌發(fā)病人數(shù)約為78.1萬，死亡人數(shù)約62.6萬[1]。肺癌的病理分型中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占總數(shù)的85%。隨著肺癌早期篩查技術(shù)的普及和治療方式的發(fā)展，1990—2015年男性肺癌患者的病死率下降45%，2002—2015年女性肺癌患者的病死率下降19%[2]。對于肺癌早期、癌細胞未轉(zhuǎn)移的患者，外科手術(shù)切除為最佳治療方式?；颊咝g(shù)后5年生存率與肺癌的分期有關(guān)，ⅠA期肺癌患者的5年生存率為90%，Ⅱ期為60%[3-4]。而對于肺癌分期較差的患者，術(shù)后輔助化療、靶向治療、免疫治療等對提高患者生存率必不可少[5-6]?？梢姡缙诤Y查、診斷與治療對于提高肺癌患者的生存率、延長患者的生存年限至關(guān)重要。因此，尋找一種能夠用于指導(dǎo)肺癌患者全程治療的生物標志物非常重要。液體活檢技術(shù)是目前研究的熱點，其是對循環(huán)血液中的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循環(huán)腫瘤細胞、外泌體和腫瘤相關(guān)血小板進行檢測的一種方法[7]。液體活檢在NSCLC中的應(yīng)用研究以ctDNA研究較為廣泛，現(xiàn)就ctDNA在NSCLC中的應(yīng)用研究進展予以綜述。

1 ctDNA的檢測

ctDNA是一種由腫瘤原發(fā)灶(繼發(fā)灶)釋放入血的腫瘤DNA，其以單鏈DNA、雙鏈DNA、DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物等形式廣泛存在于血液、腦脊液等體液中[8]。目前認為，ctDNA主要來自血液中壞死、凋亡的腫瘤細胞和腫瘤細胞分泌的外排體[9-10]。研究表明，腫瘤患者體內(nèi)血漿游離DNA的平均含量約是健康人體的6倍，血液中ctDNA具有含量低、半衰期短等特點，且其絕對含量會隨腫瘤負荷和治療反應(yīng)發(fā)生變化，所以檢測ctDNA的技術(shù)需要有較高的敏感性和特異性[11]。既往研究報道了許多不同的檢測方法，如數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實時熒光定量PCR及二代測序(next generation sequencing，NGS)等通過定性、定量檢測循環(huán)DNA的基因突變以確定ctDNA是否存在，這些檢測方法均存在各自的優(yōu)缺點[12]。如上海胸科醫(yī)院將NGS用于早期和晚期NSCLC患者的檢測時發(fā)現(xiàn)，使用NGS方法檢測血漿中ctDNA基因突變與術(shù)后病理組織基因突變檢測的陽性符合率早期為44.4%，晚期為71.4%[13]。Newman等[14]報道了一種癌癥個體化深度測序分析方法，該方法在檢測ctDNA基因突變的敏感性和特異性方面都優(yōu)于之前的檢測方法。在此基礎(chǔ)上，Newman等[15]又提出一種集成數(shù)字錯誤抑制的方法，該方法用于NSCLC患者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶突變檢測的靈敏度為92%，特異度為99.99%。隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測技術(shù)的敏感性和特異性不斷提高，已經(jīng)越來越接近臨床應(yīng)用水平。

2 ctDNA臨床應(yīng)用

2.1用于肺癌的早期篩查和早期診斷 肺癌早期篩查、早期診斷的方式多種多樣，如低劑量CT、血清腫瘤標志物檢測等。低劑量CT對具有高危風(fēng)險患者的篩查具有較高的敏感性，但同時也存在較高的假陽性率[16]。Patz等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量CT用于肺癌早期篩查的假陽性率為96.4%，總體上可能存在18.5%的過度診斷。目前血清腫瘤標志物有癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、細胞角蛋白19片段、糖類抗原、鱗狀上皮細胞癌抗原等，但上述血清腫瘤標志物對肺癌進行診斷時的敏感性和特異性均不能滿足臨床需求，因此需要一種特有的、侵入性較低的生物標志物取代或作為一種補充方式用于肺癌的早期篩查、早期診斷[18]。而ctDNA在肺癌篩查和早期診斷方面具有較大的潛力。Sozzi等[19]運用實時熒光定量PCR檢測出肺癌患者血漿DNA的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因是正常人的8倍，提示高表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因人群的患癌風(fēng)險更大。Gautschi等[20]的研究表明，血漿DNA水平與腫瘤的分期有關(guān)。以上研究表明，使用PCR分析技術(shù)對ctDNA進行檢測可作為識別肺癌高風(fēng)險人群的潛在工具。然而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用血漿ctDNA水平的基線評估并沒有提高肺癌篩查的準確性，但血漿ctDNA量化可能起到補充篩查和診斷測試的作用[21-22]。隨著腫瘤發(fā)病機制研究和分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)除了對ctDNA進行定量分析外，對ctDNA上特定的異?；蜻M行分析可能會發(fā)展成為更有前途的肺癌早期篩查與診斷的無創(chuàng)手段。Chen等[23]通過測定58例分期分別為IA、IB和IIA的早期NSCLC患者的腫瘤組織DNA和血漿ctDNA的EGFR基因、鼠類肉瘤病毒基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinasecatalytic subunit alpha，PIK3CA)、腫瘤蛋白53基因(tumor protein 53，TP53)等肺癌常見突變基因，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織DNA與血漿ctDNA突變一致率為50.4%，靈敏度為53.8%，特異度為47.3%，血漿陽性預(yù)測值為53.2%，該研究證實了檢測人群中血漿ctDNA突變用于肺癌早期篩查、診斷的可行性。但另一針對123例健康人群血漿游離DNA檢測的研究發(fā)現(xiàn)，TP53突變率高達11.4%，這對該方法的特異性提出了異議[24]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞在抑癌基因、修復(fù)基因等啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)升高，且抑制了相應(yīng)抑癌基因的表達，腫瘤細胞的高甲基化多發(fā)生于啟動子區(qū)域的CpG島，而正常細胞啟動子區(qū)的CpG島多處于非甲基化狀態(tài)[25]。Baglietto等[26]抽取吸煙患者的外周血檢測5個基因(AHRR、F2RL3、2q37.1、6p21.33、12q14.1)確定了6個CpGs的甲基化，并發(fā)現(xiàn)通過檢測這6個CpGs的甲基化有助于提高對吸煙患者罹患肺癌的風(fēng)險預(yù)測。一項研究對 48例Ⅰ期NSCLC患者的ctDNA樣本進行了DNA甲基化分析，研究覆蓋了14 500個基因的啟動子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有379個基因中的496個CpGs呈高甲基化狀態(tài)和335個基因中的373個CpGs呈低甲基化狀態(tài)[27]。這些研究均證實了檢測血液中循環(huán)DNA的甲基化可用于肺癌的早期篩查、早期診斷。目前有學(xué)者對肺癌患者血漿中單個或一組抑癌基因的甲基化作為潛在肺癌早期診斷的生物標志物進行了評估，主要包括O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、周期素依賴性蛋白激酶抑制物2A、Ras相關(guān)區(qū)域家族1A、死亡相關(guān)蛋白激酶、視黃酸受體β和人矮小同源盒基因等[28-29]。目前對于ctDNA的定量分析和特定基因的突變分析，其敏感性和特異性尚未達到臨床應(yīng)用水平，此外關(guān)于ctDNA的檢測與其他篩查手段(如低劑量CT、血清腫瘤標志物等)相結(jié)合是否能提高診斷敏感性、特異性尚未見報道，而關(guān)于ctDNA甲基化檢測能否成為NSCLC早期篩查和診斷的方法尚需大樣本臨床研究結(jié)果證實。

2.2指導(dǎo)NSCLC患者治療 肺癌的治療從單純的手術(shù)治療、化療發(fā)展到手術(shù)治療、化療、靶向治療和免疫治療相結(jié)合的綜合治療，顯著提高了肺癌患者5年生存率。化療是晚期肺癌最重要的治療手段，但其總體有效率僅為25%～35%，肺癌患者的中位生存期為8～10個月[30]。隨著21世紀精準醫(yī)療計劃的提出，精準醫(yī)療迅速成為醫(yī)藥領(lǐng)域的熱門話題[31]。而基因檢測分型在促進精準醫(yī)療的發(fā)展過程中起重要作用，在此背景下，肺癌靶向治療的快速發(fā)展為肺癌患者帶來了新的曙光。然而，靶向治療的前提條件是對腫瘤進行基因分型檢測，以尋找藥物靶點。

目前，臨床實踐中大多使用組織活檢的方法獲得腫瘤DNA，實現(xiàn)基因分型，然而組織活檢只能獲得局部和靜態(tài)的腫瘤信息，且由于腫瘤異質(zhì)性和腫瘤的不斷演變而無法反映實時的腫瘤基因分型，但是通過ctDNA進行基因檢測分析不僅能夠解決這些問題，還能解決病理組織無法取得或所取組織太少而不能進行基因檢測分型的問題，此外ctDNA的半衰期小于2 h，能實時反映肺癌在治療過程中體內(nèi)腫瘤的負荷情況[32]。Sim等[33]通過對晚期NSCLC或一線酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)耐藥患者的總共50份血漿樣品的7個基因組(BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、NRAS、PIK3CA、PTEN)進行深度測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有88%的患者至少發(fā)現(xiàn)了一個基因突變位點，50%的患者發(fā)現(xiàn)了至少一個可行的靶向治療位點。該研究結(jié)果與Thress等[34]的研究結(jié)果相似，表明對NSCLC患者血液中的ctDNA進行測序?qū)ふ宜幬镏委煱悬c的可能性。與手術(shù)或穿刺獲取病理分型相比，通過ctDNA測序獲取藥物治療靶點具有簡單、無創(chuàng)的優(yōu)點，特別適用于晚期NSCLC患者。隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測已逐步應(yīng)用于臨床。2016年5月，美國食品藥品管理局首次批準了針對NSCLC患者此類液體活檢檢測試劑盒(CobasVR EGFR Mutation Test v2)的使用，該試劑盒可用作厄洛替尼的伴隨診斷試劑盒[35]；2016年12月，首個基于NGS檢測技術(shù)的伴隨診斷試劑盒獲批上市[36]。由此可見，對血漿ctDNA基因檢測分析除了能指導(dǎo)NSCLC患者的靶向治療，也將在一定程度上促進精準醫(yī)療的發(fā)展。然而，ctDNA測序能否在臨床應(yīng)用上取代組織病理分型尚需大量研究證實。

2.3指導(dǎo)耐藥患者藥物的選擇 隨著NSCLC患者靶向治療的興起，靶向藥物耐藥問題隨之出現(xiàn)。目前關(guān)于耐藥的研究多集中于NSCLC熱點靶向藥物(以EGFR、間變性淋巴瘤激酶抑制劑為主)，約50%檢測出EGFR突變的NSCLC患者在使用第一代和第二代EGFR-TKI治療后9～13 個月內(nèi)出現(xiàn)耐藥性[37-38]。EGFR-TKI獲得性耐藥患者60%由于第20號外顯子發(fā)生錯義突變(T790M突變)，EGFR T790M被確定為獲得性EGFR-TKI耐藥的最常見機制，其他機制還包括間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal epithelial transition factor，MET)擴增、肝細胞生長因子受體(hepatic growth factor receptor，HGFR)擴增等[38-39]。接受第一代和第二代EGFR靶點藥物治療過程中出現(xiàn)T790M突變的患者，可以改用第三代Osimertinib治療?？梢?，在靶向藥物治療過程中需要對腫瘤進行基因檢測分析以發(fā)現(xiàn)耐藥突變位點，從而調(diào)整治療方案，這就要求NSCLC患者在進行靶向治療過程中需連續(xù)獲取病理組織進行基因檢測分型，以尋找明確獲得性耐藥突變位點。手術(shù)活檢、細針穿刺活檢是目前常用的獲取病理組織的方式，但這些方法存在風(fēng)險大、重復(fù)性差、取材過少不能檢測等缺點。而抽取患者外周血進行ctDNA的基因檢測分析用于耐藥的監(jiān)控和研究具有獨特優(yōu)勢，尤其對不易被活檢或手術(shù)切除腫瘤的肺癌患者有重要價值。Zheng等[40]連續(xù)監(jiān)測117例EGFR-TKI獲得性耐藥患者的血漿ctDNA，發(fā)現(xiàn)47%的患者出現(xiàn)EGFR T790M陽性。Thress等[41]對使用奧希替尼治療耐藥的15例患者的血漿ctDNA進行基因檢測分析發(fā)現(xiàn)，使用奧希替尼治療前所有患者均存在EGFR T790M突變，使用奧希替尼耐藥后發(fā)現(xiàn)，6例患者獲得了C797S突變，4例失去了T790M突變。以上研究均表明對于某種藥物耐藥的患者，對其血液中的ctDNA進行檢測可能會找到新的藥物靶點，從而指導(dǎo)患者用藥，且有益于對耐藥機制的研究。

2.4術(shù)后療效的評估 對于早期NSCLC患者，外科手術(shù)切除是最佳手術(shù)治療方式。手術(shù)效果評估多以切緣的術(shù)中冰凍結(jié)果進行判斷，但是術(shù)后患者仍存在復(fù)發(fā)風(fēng)險，Ⅰ期患者術(shù)后5 年復(fù)發(fā)率為20%，Ⅲ期患者為50%[42]。然而，目前臨床對于手術(shù)的效果評估以及術(shù)后是否需要采取輔助化療、靶向治療等沒有明確的判斷指標。一項研究通過檢測不同分期的NSCLC患者術(shù)前術(shù)后血漿ctDNA的EGFR、KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA基因突變頻率發(fā)現(xiàn)，91.7%在術(shù)前ctDNA檢測中出現(xiàn)突變的Ⅰa、Ⅰb期患者的突變頻率在2 d內(nèi)發(fā)生了下降，其平均突變頻率從術(shù)前的8.88%下降為術(shù)后的0.28%，其原因是腫瘤的切除而導(dǎo)致ctDNA的釋放減少；此研究還提出，未來有希望通過檢測患者術(shù)前術(shù)后血漿ctDNA 的突變頻率來判斷手術(shù)療效[43]。Hu等[44]對168例肺癌患者術(shù)前、術(shù)后ctDNA進行定量分析和基因突變分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后仍能檢測到ctDNA基因突變或術(shù)后ctDNA水平較高的患者具有更高的復(fù)發(fā)率。該研究表明，在術(shù)后進行ctDNA檢測分析有希望用于手術(shù)療效的評估以及為術(shù)后患者是否需要行輔助治療提供參考。

另外，手術(shù)切除腫瘤后的微小殘留病灶(minimal residual disease，MRD)作為ctDNA的來源之一逐漸引起了人們的注意，有報道稱，1例行手術(shù)治療和術(shù)后化療復(fù)發(fā)的患者，在放射性標準診斷復(fù)發(fā)前20個月就在其ctDNA中檢測到最小等位基因頻率為 0.04%[45]。隨著ctDNA檢測技術(shù)的發(fā)展，更多的低頻突變基因能夠被用于檢測判定患者體內(nèi)的MRD。有證據(jù)表明，ctDNA可在臨床疾病復(fù)發(fā)之前監(jiān)測到MRD，如ctDNA在乳腺癌治療后的MRD監(jiān)測，但這種方法在改善患者預(yù)后方面的價值需前瞻性介入試驗加以證明[39，46]。以上研究均證明了基于目前ctDNA檢測技術(shù)的發(fā)展，有望在NSCLC患者術(shù)后通過對ctDNA進行定量分析或基因突變分析以判斷手術(shù)療效并評估是否需要術(shù)后輔助治療，以及術(shù)后定期評估血液中的ctDNA以判斷是否存在分子殘留腫瘤，以達到早期干預(yù)并提高生存率的目的。

2.5預(yù)后與復(fù)發(fā)的評估 目前，臨床尚未有明確的指標用于評估NSCLC患者的預(yù)后和復(fù)發(fā)，術(shù)后多使用影像學(xué)檢查隨訪，然而影像學(xué)檢查具有明顯的滯后性和價格昂貴等缺點。隨著液體活檢的興起，有研究報道了ctDNA與NSCLC患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的相關(guān)性，如Sozzi等[21]研究證明，肺癌術(shù)后血液中ctDNA 水平較高患者的5年生存率明顯低于血液中循環(huán)ctDNA水平較低的患者。

Chaudhuri等[45]研究表明，肺癌治療后抽取的血液樣本中能檢測到ctDNA的患者具有較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率，與放射性檢查相比，ctDNA檢測在評估術(shù)后復(fù)發(fā)方面具有較高的敏感性，同時需要進一步評估是否存在過度治療。一項大樣本的前瞻性研究也證明了術(shù)后30 d患者ctDNA中KRAS和EGFR突變的水平也可以作為評估預(yù)后的參考值[44]。也有研究表明，在靶向治療過程中，通過檢測血漿ctDNA而出現(xiàn)獲得性耐藥基因突變的患者，其中位生存期明顯短于突變陰性的患者[47]。隨著研究的深入，ctDNA的檢測有望在NSCLC患者的預(yù)后和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。

3 小 結(jié)

基于液體活檢技術(shù)的快速發(fā)展，ctDNA作為無創(chuàng)生物標志物正逐步應(yīng)用于臨床。ctDNA的檢測具有無創(chuàng)、可重復(fù)等優(yōu)點，可在NSCLC患者的早期診斷、指導(dǎo)治療和評估預(yù)后等方面發(fā)揮出巨大的潛在臨床應(yīng)用價值。隨著“精準醫(yī)療”方法的提出，將ctDNA作為基因水平的標志物是未來重要發(fā)展方向。但是存在ctDNA的檢測無統(tǒng)一的定量標準、不同的檢測方法差異較大等問題，且目前尚無大樣本臨床研究數(shù)據(jù)證明，ctDNA可以直接應(yīng)用于臨床。將來隨著腫瘤發(fā)病機制的深入研究和分子檢測技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測有望真正運用于肺癌的臨床診療。