腸道病毒71型抗病毒藥物的最新研究進展

孫建東，陶臻

(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院感染科,南京 210006)

近年來，手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的發(fā)病率和死亡率一直居中國C類傳染病的首位[1]，2018年其發(fā)病例數(shù)高達200萬，其中有35人死亡[2]。嬰幼兒HFMD是一種自限性疾病，通常以發(fā)熱，手、足、口、臀部的皮疹等癥狀為主。與柯薩奇病毒相比，腸道病毒71型(enterovirus A71，EV-A71)引起的HFMD更易導致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、循環(huán)系統(tǒng)衰竭及急性肺損傷等，甚至死亡[3]。EV-A71是一種微小病毒科腸病毒屬病毒，其基因組是一種單鏈正義RNA。EV-A71首先與細胞表面的受體結合，通過內吞作用進入細胞，并在內體中脫殼。病毒RNA進行依賴內部核糖體進入位點的翻譯啟動合成，且多聚蛋白被2A和3C蛋白酶切割成結構和非結構蛋白。然后將正義病毒RNA裝入衣殼，最后成熟為感染性病毒顆粒。2018年，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《手足口病診療指南(2018版)》指出，α干擾素、利巴韋林的早期使用有一定的抗病毒療效，但目前臨床仍缺乏治療EV-A71感染的有效手段[4-5]。雖然已有3家中國公司的EV-A71 疫苗獲批上市[6]，為預防HFMD提供了有效手段，但市場上仍沒有特效的抗EV-A71藥物[7]。EV-A71疫苗因尚未納入國家免疫計劃難以推廣普及，尤其是在一些農村地區(qū)可接受性和覆蓋率更低[8]，這為EV-A71感染的防治帶來更多困難與挑戰(zhàn)。隨著對EV-A71感染研究的深入，針對EV-A71生命周期靶點的抗病毒藥物已成為當前研究熱點之一。與病毒復制周期密切相關的功能蛋白均可以作為抗EV-A71 藥物開發(fā)的靶點[7]?，F(xiàn)就EV-A71抗病毒藥物的最新研究進展予以綜述。

1 針對病毒附著和進入的藥物

識別特異性受體并與之相互作用的能力是決定病毒宿主范圍和組織嗜性的因素之一。由于病毒感染宿主細胞的第一步是與細胞表面的受體結合，因此阻止該事件的抑制劑可以作為潛在的治療藥物。EV-A71附著于易感細胞后，介導病毒穿入細胞內的受體，包括人類清道夫受體B2、P選擇素受體1、唾液酸化糖蛋白、硫酸乙酰肝素、核蛋白、膜聯(lián)蛋白Ⅱ、波形蛋白及熱激蛋白70等。

5H7是一種新型抗VP3的單克隆抗體。在人類清道夫受體B2的競爭性拉下實驗中，5H7阻斷EV-A71上的受體結合位點以進行病毒中和[9]。人鼠嵌合5H7的被動免疫100%保護2周齡AG129小鼠免受EV-A71 B4菌株的致死性攻擊[9]。VP3單克隆抗體5H7是一種特異性抗病毒藥物，可用于急性感染患者的被動免疫，因此可用于預防性和治療性治療。另外，病毒受體的單克隆抗體也可以通過其他機制降低EV-A71感染率。人類清道夫受體B2不僅介導EV-A71與宿主細胞的結合，還參與病毒感染的內吞作用和脫殼作用。Zhang等[10]合成了抗人類清道夫受體B2的單克隆抗體JL2，其至少可通過兩種可能的方式阻斷EV-A71感染：①JL2與EV-A71競爭結合人類清道夫受體B2；②JL2可以在中性pH值下穩(wěn)定人類清道夫受體B2結構，并防止EV-A71脫殼。但在EV-A71病毒載量較高時，受體阻斷劑不能很好地中和病毒，這可能與細胞表面存在多種EV-A71受體有關。

此外，還可以通過合成病毒受體類似物抑制EV-A71的感染。EV-A71病毒受體硫酸乙酰肝素是一種帶負電荷的線性多糖，它可以與核心蛋白共價結合形成硫酸乙酰肝素蛋白多糖。硫酸乙酰肝素蛋白多糖是細胞外基質的主要功能成分，參與一系列的生物過程。Earley等[11]開發(fā)出了硫酸乙酰肝素類似物，它是EV-A71病毒感染的有效小分子抑制劑，與病毒衣殼結合，作為誘餌受體來阻止病毒復制。在EV-A71體外感染實驗中，硫酸乙酰肝素類似物22的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)值為7.9 μmol/L[11]。硫酸乙酰肝素類似物22通過抑制病毒-細胞相互作用的早期階段來阻止EV-A71感染，表明該類受體類似物可與病毒衣殼蛋白結合，從而競爭性抑制病毒與細胞受體結合。因此，病毒受體類似物可能是一種新的輔助治療EV-A71感染的潛在藥物，但其也存在抗病毒效果差的問題。

2 針對病毒脫殼的藥物

EV-A71衣殼蛋白由基因組的P1區(qū)編碼，衣殼顆粒包含60個拷貝的4個P1區(qū)編碼的多肽：VP1～VP4。其中，前3個病毒衣殼蛋白(VP1～VP3)位于病毒的外表面，而較短的衣殼蛋白VP4完全位于衣殼的內表面。衣殼蛋白通過結合宿主膜上的受體來介導病毒感染的開始。病毒受體N端結構域D1與衣殼蛋白上保守氨基酸殘基結合，觸發(fā)EV-A71的不穩(wěn)定和脫殼。脫殼抑制劑作用的機制為與VP1疏水口袋緊密結合，穩(wěn)定衣殼結構，從而阻斷病毒脫殼。病毒衣殼蛋白VP1是一個抗病毒靶點，因為它被合適的化合物占據(jù)可以穩(wěn)定病毒的衣殼，從而防止病毒脫殼后RNA釋放。

WIN系列化合物是一類重要的衣殼結合劑，它可與EV-A71衣殼蛋白VP1特異性結合。普可那利是其中一種病毒衣殼結合劑，其雖具有良好的抗病毒效果，但對普可那利自然耐藥的病毒已有報道。耐藥性問題可能使衣殼結合劑在臨床的應用受到限制。有學者利用WIN系列化合物的骨架作為模板，發(fā)現(xiàn)了一系列新的咪唑烷酮衍生物，這些咪唑烷酮衍生物對EV-A71具有更顯著的抗病毒活性[7]。其中最有前景的咪唑烷酮化合物14對EV-A71表現(xiàn)出良好的抗病毒活性(半數(shù)效應濃度值為4×10-3μmol/L)，并在感染EV-A71的小鼠模型中顯示出良好療效[7]。此外，有研究人員用WIN 51711衣殼蛋白抑制劑研究了EV-A71的結構，發(fā)現(xiàn)抑制劑取代了VP1衣殼結合疏水口袋內的天然口袋因子而不改變衣殼的結構[12-13]。與WIN 51711、ALD和NLD等咪唑烷酮衍生物的作用機制相同，迷迭香酸與VP1衣殼疏水口袋結合，其與芳香族氨基酸Phe135、Phe155通過疏水作用在VP1衣殼中相互作用[14]。迷迭香酸在EV-A71感染人橫紋肌肉瘤細胞早期表現(xiàn)出強烈的保護作用，當感染復數(shù)為1時,IC50低至(4.33±0.18) μmol/L，治療指數(shù)高至340。迷迭香酸不僅可以保護細胞不受EV-A71誘導的細胞病變影響，還可以保護細胞不受EV-A71誘導的凋亡影響。以上研究表明，結構分析可能成為抗EV-A71衣殼結合藥物發(fā)展的新思路。

3 針對病毒多聚蛋白的藥物

EV-A71的基因組編碼11種蛋白質，包括4種病毒衣殼蛋白(VP1～VP4)和7個非結構蛋白(2A～2C和3A～3D)。在這些病毒蛋白中，EV-A71 2A蛋白酶和EV-A71 3C蛋白酶已被證實在病毒-宿主相互作用和EV-A71發(fā)病機制中起重要作用[15-16]。因此，參與多聚蛋白加工及病毒復制的蛋白酶成為抗EV-A71 藥物研究的焦點。

EV-A71 3C蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，除EV-A71 2A蛋白酶對VP1/2A和3C/3D的切割外，它幾乎參與EV-A71多聚蛋白的所有裂解過程。EV-A71 3C蛋白酶是形成各種多聚蛋白的關鍵酶，它被認為是研發(fā)HFMD藥物的一個關鍵靶點。目前已報道了多種針對EV-A71 3C蛋白酶的抑制劑，包括底物類藥物、黃酮類化合物、α-酮酰胺類化合物等。

雖然底物基肽擬合物蘆平曲韋被發(fā)現(xiàn)具有較強的抗EV-A71 3C蛋白酶活性(IC50值為2.3 μmol/L)，但由于生物利用度低，蘆平曲韋沒有通過Ⅱ期臨床試驗[17-18]。DC07090是一種新型的非基肽小分子抑制劑，其抗病毒效果較好[IC50值為(21.72±0.95) μmol/L]，且無明顯毒性[50%細胞毒性濃度(50% cytotoxic concentration，CC50)>200 μmol/L][19]。此外，DC07090也可抑制柯薩奇病毒復制，可用于進一步開發(fā)針對EV-A71或其他小核糖核酸病毒的抗病毒治療，但需注意其生物利用度的問題。

與黃酮類化合物蘆丁的作用相似，黃體苷以劑量依賴方式(IC50為3.6×102μmol/L)阻斷EV-A713C蛋白酶活性[20]。有研究首次評估了多種黃酮類化合物在新生小鼠體內的抗EV-A71活性，黃酮類化合物顯示出較大的抗病毒活性，其中異鼠漢素對小鼠的生存保護作用最強，在10 mg/kg的劑量下可提供100%的保護[21]。但黃酮類化合物的具體作用機制和安全性問題仍有待進一步探索。

Zeng等[18]合成了EV-A71 3C蛋白酶抑制劑α-酮酰胺衍生物，并對其生化活性和抗病毒活性進行了分析。結果顯示，抑制劑8v、8w、8x是最佳的α-酮酰胺抑制劑[IC50值分別為(1.32±0.26) μmol/L、(1.88±0.35) μmol/L和(1.52±0.31) μmol/L]。在體外細胞毒性實驗中，所有α-酮酰胺抑制劑均表現(xiàn)出較低的細胞毒性(CC50>100 μmol/L)[18]。此外，Wang等[22]報道了一種高度特異性的α-羥基腈衍生物NK-1.9k，它對EV-A71 3C蛋白酶的選擇性顯著高于其他絲氨酸蛋白酶。他們在基于細胞的病毒增殖實驗中觀察到NK-1.9k的抗病毒活性[半數(shù)效應濃度為(37.0±0.1)×10-3μmol/L]，且具有低細胞毒性(CC50>200 μmol/L)。雖然病毒蛋白酶因其底物特異性被認為是可能的靶點，但大多數(shù)藥物處在實驗室基礎研究階段，還需進一步的體內實驗和臨床驗證。

4 針對病毒復制的藥物

在EV-A71 RNA復制過程中，病毒3D蛋白作為一種RNA依賴的RNA聚合酶，在胞質中合成互補負鏈。RNA合成發(fā)生在病毒誘導的細胞膜小泡外表面的復制復合體中。新合成RNA從復制復合體中釋放出來，可能進入另一輪的翻譯和復制，或通過衣殼蛋白包裹產生子代病毒。因此，調節(jié)病毒復制的信號通路，參與病毒復制的核酸及功能蛋白等可作為抗病毒藥物作用的靶點。

p38激酶的激活促進EV-A71的復制，抑制p38促分裂原活化的蛋白激酶通路可抑制EV-A71翻譯。PD169316作為一種p38抑制劑，可高度抑制EV-A71的復制和細胞凋亡。在哺乳小鼠模型中，PD169316可通過抑制病毒復制、組織損傷和炎癥細胞因子分泌，有效治療EV-A71感染[23]。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)，在EV-A71病毒附著后，駱駝蓬堿通過抑制核因子κB信號通路抑制EV-A71復制。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，駱駝蓬堿體外阻止EV-A71感染的半數(shù)效應濃度值為20 μmol/L，CC50為500 μmol/L[24]。此外，駱駝蓬堿還可保護AG129小鼠對抗EV-A71體內復制。雖然EV-A71有不同的基因型，但通過抑制病毒復制的信號通路可以減少耐藥和失效的發(fā)生，這為抗EV-A71藥物的成功研制提供了新方向。

微RNA(microRNA，miRNA)是一種高度保守的非編碼單鏈RNA，長度通常為19～25個核苷酸。這些RNA主要通過與靶信使RNA上的互補序列結合來調節(jié)特定基因的表達，以調節(jié)它們的翻譯或穩(wěn)定性[25]。miRNA不僅在基因表達調控中發(fā)揮重要作用，還參與病毒復制的調控。miR-2911是一種金銀花非典型miRNA[26]。金銀花編碼的miR-2911通過靶向VP1基因抑制EV-A71復制[27]。而另一實驗發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p通過靶向核因子κB通路抑制EV-A71復制[28]。miRNA的抗病毒機制為抑制病毒復制相關信號通路，但因RNA結構不穩(wěn)定，故使其在應用中受限。

A3G是一種干擾素誘導的細胞蛋白，可抑制多種病毒的復制。A3G通過病毒DNA胞苷脫氨作用抑制逆轉錄病毒復制，從而導致病毒基因組的G-to-A超突變，或僅以脫氨酶活性的方式破壞逆轉錄或基因組包膜[29]。對于EV-A71，A3G是一種機體固有的抗病毒因子，EV-A71非結構蛋白2C通過自噬-溶酶體途徑誘導A3G降解，從而克服A3G對病毒復制的抑制[30]。Wang等[31]證明了A3G可以通過RNA依賴的RNA聚合酶和病毒RNA相互作用，并被包裝成子代病毒粒子，以降低其傳染性。這些發(fā)現(xiàn)為減少EV-A71的傳播提供了新方法。

此外，還有一些治療其他疾病的藥物對EV-A71也具有抗病毒活性。米卡芬凈是食品藥品管理局批準的一種棘白菌素抗真菌藥物，其主要用于治療念珠菌感染相關疾病。研究發(fā)現(xiàn)，米卡芬凈能有效抑制EV-A71的增殖，并以較低的IC50(5 μmol/L)抑制細胞中EV-A71復制子的復制[32]。米卡芬凈對EV-A71復制子的強抗病毒作用和根據(jù)時間點添加藥物的實驗結果表明，在EV-A71感染期間，米卡芬凈作用于非病毒粒子的胞內過程[32]。這項研究揭示了米卡芬凈作為EV-A71有效抑制劑的新適應證，為成功研制抗EV-A71藥物提供了更快的途徑。

5 針對病毒裝配與釋放的藥物

目前，針對EV-A71裝配與釋放的藥物研究較少，但胞內囊泡轉運和子代病毒釋放也可作為EV-A71 的抗病毒靶點。Retro-2cycl和Retro-2.1是專門針對細胞內囊泡轉運病原體的抑制劑，它們參與包括子代病毒釋放在內的EV-A71的生命周期過程[33]。有文獻報道Retro-2cycl和Retro-2.1在細胞病變效應抑制實驗中，分別以12.56 μmol/L和0.05 μmol/L的50%有效濃度抑制EV-A71感染，且細胞毒性較低(CC50分別為500 μmol/L和267.80 μmol/L)[34]。其中，10 mg/kg的Retro-2cycl的保護效果最好，每日1次，連續(xù)7 d，新生小鼠的存活率為90%(EV-A71對照小鼠的存活率為10%)[34]。Retro-2cycl和Retro-2.1通過抑制子代病毒的釋放，對EV-A71具有抗病毒作用。該研究首次確定了子代病毒釋放和胞內囊泡運輸可以作為EV-A71的抗病毒靶點，但還需進一步臨床研究。

6 其他抗病毒藥物

近年來，中草藥被廣泛應用于病毒感染性疾病，許多中草藥在體外均具有抗病毒活性。臨床研究已證實中草藥在EV-A71感染中的抗病毒作用，如喜炎平[35]、黃芩[36]、升麻和紫草[37]等。在臨床治療的基礎上，眾多學者致力于研究中藥抗EV-A71的有效成分及其有效成分與病毒的相互作用機制，如艾蒿[38]、荊芥[39]、駱駝蓬[24]等。雖然中藥的抗病毒療效值得肯定，但其主要有效成分抗病毒的具體機制仍不清楚，不同成分之間的相互作用也需進一步闡明。

7 小 結

EV-A71是繼脊髓灰質炎被基本消滅后的另一種重要嗜神經(jīng)病毒[40]。目前，針對EV-A71復制周期的藥物研發(fā)大多處于實驗室研究階段，尚無特效抗EV-A71藥物應用于臨床?？共《舅幬锏淖饔脵C制復雜，EV-A71感染會觸發(fā)相互作用的信號通路，導致宿主免疫逃避和炎癥反應[16]。抑制這些反應和通路可發(fā)揮抗病毒效果，故對EV-A71感染引起的炎癥反應及其信號通路的深入研究能為HFMD的治療提供新選擇[15，41]。雖然聯(lián)合用藥可以增加抗病毒活性，但EV-A71基因組對于病毒復制無校對活性RNA。因此，在病毒復制過程中經(jīng)常發(fā)生突變，導致許多變異和抗藥突變株的產生，這使得EV-A71抗病毒藥與疫苗的研發(fā)更加復雜和困難。雖然中國已經(jīng)批準了兩種EV-A71滅活疫苗[21,42]，但由于沒有具體的臨床治療方法，抗病毒藥物的開發(fā)仍非常緊迫。有學者發(fā)現(xiàn)，治療其他疾病的臨床用藥，如米卡凈芬[32]和米諾環(huán)素[43]等具有抗EV-A71活性，這為成功治療HFMD帶來了希望。未來，相信抗病毒藥物與有效疫苗的結合將加速EV-A71的根除。