宏基因組學二代測序在免疫功能受損不明原因肺部感染患者病原鑒別中的意義*

張 弦 ，顧宇峰 ，趙 華 ，周 躍 ，金愛萍 ，張 彬 ，張海峰

（南通大學附屬醫(yī)院1 感染性疾病科；2 影像中心，江蘇226001）

近年來隨著器官移植、骨髓移植的不斷開展, 以及惡性腫瘤的化放療、風濕免疫性疾病免疫抑制治療、血液病診治逐漸增多，免疫功能低下合并肺部感染患者逐年增加，也使得免疫功能受損肺部感染患者的病原體更為復雜和多樣[1]。在免疫功能受損人群肺部感染發(fā)生率較免疫功能正?；颊吒撸筛哌_70% 以上，普遍存在下呼吸道難以直接采集標本、檢測標本留取不合格、病原體診斷困難、多而復雜等問題。治療因病原體不能明確，多限于經驗性抗感染治療不能精準施治。因此，準確、早期明確病原體并進行針對性抗感染治療對這類患者預后至關重要。針對今年新冠病毒肺炎可疑病人排查過程的特殊性，對我院2020 年1 月—4 月收治不明原因肺部感染患者20 例加以回顧性分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 不明原因肺部感染患者20 例，其中男性 8 例，女性 12 例；年齡 17～82 歲，平均 56.30±16.91 歲。納入標準：（1）入院時查血常規(guī)白細胞總數正?；蚪档停夭緾T 示肺部外帶新發(fā)磨玻璃樣結節(jié)或炎癥滲出斑片影；（2）入院后查T 淋巴細胞亞群，示 CD4+T 淋巴細胞降低；（3）入院后間隔24 小時取兩次咽拭子送新冠病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測陰性；（4）入院后系統(tǒng)排查未能明確肺部感染病原體者。系統(tǒng)篩查包括血、尿、大便三大常規(guī)，大便隱血試驗，肝、腎功能，電解質，血糖，血、尿、痰培養(yǎng)，甲型流感、乙型流感、呼吸道7 種病毒檢測、支原體、巨細胞病毒、EB 病毒等。所有患者入院檢查血常規(guī)：白細胞總數多正?；蚪档停?.65±3.40）×109/L；除 1 例淋巴瘤、粒細胞缺乏檢出屎腸球菌患者降鈣素原（PCT）高達 20.61 ng/mL，HS-CRP 262 mg/L；其余患者 PCT 低于 0.5 ng/mL (0.31±0.35 ng/mL)、HS-CRP小于 100 mg/L（68.69±69.85 mg/L）。CD4+淋巴細胞均低于 400/μL（259.58±118.87/μL）。

1.2 標本留取 于入院當日及24 小時后檢測兩次新冠病毒核酸陰性初步排除新冠病毒肺炎后外送病原mNGS 檢測：根據患者臨床表現以及實驗室篩查結果，經醫(yī)患充分溝通，患方簽署針對mNGS 高額費用知情同意書及采信院外檢查結果知情同意書。發(fā)熱時，留取可疑部位血液、尿、痰或肺泡灌洗液、胸水、腦脊液等標本，一份送本院微生物室作細菌培養(yǎng)，另留一份mNGS 標本外送華大基因檢測公司作病原學檢測。mNGS 標本的采集、保存和運輸嚴格按照該公司標準化規(guī)范執(zhí)行。

1.3 病原學mNGS 檢測

1.3.1 標本處理和DNA 提?。貉簶吮倦x心后取300 μL 血漿，痰液或肺泡灌洗液經玻璃珠混合震蕩后取0.5～3 mL，腦脊液取300 μL。使用TIANamp Micro DNA Kit（DP316，TIANGEN BIOTECH，Beijing,China），根據試劑盒說明書提取DNA（用作DNA 文庫構建），應用超聲破碎至200～300 bp 的片段備用。

1.3.2 文庫構建和測序、數據分析：使用Agilent 2100 Bioanalyzer 質控文庫、Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）質控 DNA 文庫，文庫經環(huán)化后再滾環(huán)復制（RCA）形成DNB 納米球，然后加載至測序芯片，應用BGISEQ-500 進行高通量mNGS 測序。測序所得原始結果中去除質量低的數據，通過所得高質量數據中比對BWA：（http://biobwa.sourceforge.net/）去除人參考基因組序列和低復雜度結果（Reads），最后參照微生物大數據庫，將比對后的數據按照細菌、直菌、病毒、寄生蟲、支原體/衣原體等分類羅列形成初步實驗室報告。對于與細菌培養(yǎng)結果明顯不符、高度懷疑的病原學mNGS 結果，采用PCR 擴增/Sanger 測序驗證。

1.4 臨床解讀 臨床醫(yī)生根據患者病情進展、影像學檢查、本院病原微生物流行病學史、前期經驗性抗菌藥物療效以及既往診療經驗，全面分析傳統(tǒng)細菌直菌培養(yǎng)、各種血清學病原檢測報告、mNGS 病原檢測報告，區(qū)分非無菌部位定植與感染，去除mNGS 背景病原檢測假陽性結果，確定免疫力受損肺部感染患者相關致病病原體。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析處理。病原mNGS 與傳統(tǒng)培養(yǎng)結果比較采用配對χ2檢驗，兩種方法診斷結果的一致性采用Kappa 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 病原體檢測陽性結果 20 例共送檢23 份標本檢測病原mNGS，血、胸水等無菌標本病原mNGS 共15 例，結果4 例血標本未檢測到任何病原體，其余11 例共報告細菌7 種7 例次，其中口腔消化鏈球菌、衣氏放線菌、銅綠假單胞菌、卟啉單胞菌、伊氏李斯特菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌各1 例次；病毒3種4 例，其中單純皰疹病毒-1、巨細胞病毒各1 例次、EB 病毒2 例次；直菌3 種7 例次，其中煙曲霉2例次、耶氏肺孢子菌4 例次。咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等非無菌標本病原mNGS 檢測共8 例均有陽性病原體報告，檢出的病原體數量和種類明顯多于無菌標本，其中細菌7 種11 例次，其中屎腸球菌、肺炎鏈球菌、星座鏈球菌、結核分枝桿菌復合群、格雷文尼放線菌各1 例次、牙齒放線菌2 例次、副流感嗜血桿菌4 例次；病毒2 種3 例次，其中巨細胞病毒1 例次、EB 病毒2 例次；直菌4 種6 例次，其中煙曲霉菌、耶氏肺孢子菌、近平滑念珠菌各1 例次、白色念珠菌3 例次、支原體1 種1 例次，為口腔支原體。而傳統(tǒng)細菌直菌培養(yǎng)僅兩例報告了白色念珠菌，其病原mNGS檢測中亦報告了白色念珠菌，未見其他病原體陽性報告。病原mNGS 檢測2 例淋巴瘤患者1 例痰標本、1 例肺泡灌洗液，均有5 種病原微生物報告。

2.2 病原mNGS 與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測細菌、真菌陽性結果比較 傳統(tǒng)細菌直菌培養(yǎng)僅檢出2 例白色念珠菌，而病原mNGS 檢測共檢出19 例細菌直菌（含結核分枝桿菌1 例）；相比之下，病原mNGS 在23 份標本中鑒定出39 個病原體，多為培養(yǎng)不易獲得的細菌、直菌。病原mNGS 檢測陽性率82.61%（19/23），高于傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率8.7%（2/23），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。Kappa 一致性檢驗表明，病原 mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)診斷結果一致性較差（Kappa＜0.4）。另外，病原mNGS 還檢測出單純皰疹病毒-1、巨細胞病毒、EB 病毒、支原體共 8 例。

3 討 論

由于新的抗菌藥物和抗逆轉錄病毒藥物等抗微生物藥物廣泛應用，免疫功能受損患者盡管對各種機會感染的易感性增加，但預后較前有所改善，肺部感染仍是這類患者常見感染，且其病原學確診一直困擾臨床醫(yī)生[2]。傳統(tǒng)檢測感染病原體主要依靠可疑部位標本培養(yǎng)以及分子生物學診斷技術，微生物培養(yǎng)目前仍是感染病原診斷的金標準，但其存在耗時長、不同病原體需不同培養(yǎng)基、陽性率過低等缺陷。分子生物學診斷方法，如酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）原位雜交、聚合酶鏈式反應（PCR）、一代桑格測序均依賴于病原體核酸的已知序列[3]，每次檢測僅識別有限甚至特定的病原體種類。這對免疫功能受損肺部感染患者病原學識別存在明顯不足，因為免疫功能低下患者肺部感染通常同時發(fā)生多種條件致病感染性疾病，如常見耶氏肺孢子菌（PCP）同時合并巨細胞病毒（CMV）的感染，亦可于病程中序貫出現不同病原體感染，如病毒感染后繼發(fā)直菌或細菌感染。本研究發(fā)現，20 例CD4+T 淋巴細胞減少免疫功能受損肺部感染患者傳統(tǒng)細菌直菌培養(yǎng)僅2 例報告了白色念珠菌，陽性率不高8.7%（2/23），未見其他病原體陽性報告，而病原mNGS 檢測陽性結果明顯高于傳統(tǒng)方法，且同期同類標本中亦檢測出白色念珠菌。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比，病原mNGS 檢測由于其獨特的機制，具有更廣的微生物檢出譜，作為近年來更敏感的理想感染病原學檢測方法，正成為新的研究熱點；其對病原微生物幾乎達到“一網打盡”效果，能同時一次性敏感識別不同類病原體[4]，尤其在細菌感染合并直菌、病毒、支原體、衣原體或原蟲等感染時更具顯著意義。一份合格的病原mNGS 檢測報告，需從規(guī)范取樣開始，經嚴格的質控:去除人源化基因組成成份、數據過濾、與病原數據庫中的參考序列進行比對；結合患者相關臨床信息，排除疑似背景微生物才最終形成包括檢測病原微生物列表、檢出病原序列數量、所檢測病原范圍、檢測方法及檢測技術說明的實驗室報告[5]；正式病原微生物報告為符合病原mNGS判讀標準的所有病原微生物，如檢出的疑似病原微生物——細菌、病毒、直菌和寄生蟲，并于附錄中列出背景微生物[6]。本研究結果顯示，病原mNGS 在23份標本中實驗室鑒定出39 個病原體，多為培養(yǎng)不易獲得的細菌、直菌；根據患者臨床表現、血常規(guī)、PCT、hCRP、前期經驗性治療效果，最終判定細菌直菌病原mNGS 結果共19 例細菌直菌（含結核分枝桿菌1 例），陽性率達到82.61%（19/23）；另外在不易由培養(yǎng)獲得的寡養(yǎng)細菌、直菌、病毒、支原體等少見病原體，病原mNGS 檢測存在明顯優(yōu)勢，本研究中還檢測出單純皰疹病毒-1、巨細胞病毒、EB 病毒、支原體共8 例。目前病原mNGS 檢測較傳統(tǒng)培養(yǎng)在排查致病病原微生物方面優(yōu)勢已獲得多數專家的認可：病原mNGS 檢測報告中微生物檢出序列數異常升高，在排除背景菌、污染菌和定植菌的情況下，可結合臨床判定該微生物為致病病原體；胞內菌如布魯菌、結核分枝桿菌等因釋放到體液中含量較少、直菌等厚壁的病原微生物核酸提取率較低，均可降低檢出率致敏感性下降，所以對胞內菌和厚壁微生物如直菌mNGS 檢出陽性率低，即使報告中序列數或豐度不高，結合臨床排除定植后，仍判定為感染致病病原[6]；綜上不難發(fā)現病原mNGS 檢測尤其在結核、厭氧菌、直菌和病毒等診斷方面優(yōu)勢明顯，且文獻報告采樣前使用抗菌藥物對mNGS 的影響明顯小于傳統(tǒng)培養(yǎng)[7]。另有研究[8]發(fā)現存在免疫功能抑制患者感染病原體篩查中，在病毒和細菌診斷方面病原mNGS 檢測陽性率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，同時病原mNGS 檢測結果的陰性預測意義更大。但是病原mNGS 如此高的敏感性，也為臨床判斷致病病原帶來麻煩[2，7]，本研究中2 例淋巴瘤患者（CD4+淋巴細胞均低于200/μL）1 例痰標本、1 例肺泡灌洗液，均有五種病原微生物報告。因病原mNGS 技術層面不足，難以形成統(tǒng)一量化的判定標準，一般檢測機構不作致病微生物結果判定，僅盡可能提供詳細檢測結果列表（陽性結果的實驗室報告），最終交由經驗豐富的臨床醫(yī)生根據留取標本類型、排除背景微生物、結合患者的臨床表現、傳統(tǒng)的病原培養(yǎng)、血清學檢測報告和影像等輔助檢查，評判定植、背景還是致病微生物[6]。

本研究發(fā)現，無菌標本如血液、胸水等病原mNGS 檢測結果中4 例血液標本未檢測到任何病原體；而非無菌標本如咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等病原mNGS 檢測共8 例均有陽性病原體報告，且檢出的病原體數量和種類明顯多于無菌標本。究其原因，本組病例均為肺部感染，與感染部位相關的呼吸道分泌物病原體檢測陽性結果應高于血液等無菌標本，再者因免疫力受損患者各種條件致病機會感染增多，多數常規(guī)培養(yǎng)不易獲得的寡養(yǎng)細菌、直菌、病毒等能由病原mNGS 檢測從呼吸道標本中檢出[9-10]；另外在留取標本前，患者在當地醫(yī)院因懷疑細菌、直菌感染，已經驗性使用抗菌藥物，導致無菌標本病原微生物不易培養(yǎng)；傳統(tǒng)培養(yǎng)僅能檢測到一種優(yōu)勢病原體，而其他合并感染的病原體可能被抑制而無法檢出，而mNGS 可檢出更微量的病原體核酸，具有更高的敏感性、病原體檢出更全面。

本文病原mNGS 檢測陽性率82.61%（19/23）遠高于傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率8.7%（2/23），由于收集病例數偏少，難免存在偏差，有待擴大檢測例數來驗證；本組病例為SARS-CoV-2 疫情期間住院患者，入院常規(guī)兩次SARS-CoV-2 核酸檢測陰性后，再留取相關標本外送，對病情與檢查結果可能存在一定影響。感染病原mNGS 檢測自身存在檢測技術要求高、假陽性結果、RNA 病毒易降解、儀器設備昂貴等不足之處，難以在各家醫(yī)院普及[6]，多數醫(yī)院需外送標本定點檢測。隨著公司布點增多、技術進步，縮短檢測周期和降低檢測費用，病原mNGS 檢測在臨床上可更好地服務于患者。