非洲豬瘟實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)關(guān)鍵要素和實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

莫榮艷

（來(lái)賓市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 546100）

PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)自從1985 年問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)過(guò)三十幾年的發(fā)展，已成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)。 近年來(lái)，PCR 技術(shù)有了重大改進(jìn)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的原理是一種實(shí)時(shí)監(jiān)控核酸擴(kuò)增的技術(shù)，在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化對(duì)PCR 過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。

1 實(shí)時(shí)熒光PCR 與普通PCR 相比， 實(shí)時(shí)熒光PCR 具備幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)

實(shí)時(shí)熒光PCR 采用封閉的檢測(cè)模式，閉管反應(yīng)，杜絕污染；因此擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致污染的可能性比普通PCR 要小得多。 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)在PCR 擴(kuò)增過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行，并且數(shù)據(jù)的采集、分析全部由儀器自動(dòng)完成，快捷方便無(wú)需電泳，40～60min 完成；檢測(cè)方法多樣， 應(yīng)用靈活。 整個(gè)檢測(cè)所需的時(shí)間比普通PCR 要節(jié)省許多。實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)模式功能強(qiáng)大，高準(zhǔn)確度是目前公認(rèn)的定量標(biāo)準(zhǔn)；具備定性、定量等檢測(cè)功能。 而普通PCR 要完成上述項(xiàng)目需采用不同的技術(shù)平臺(tái)。

2 非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)關(guān)鍵要素

實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)及設(shè)施設(shè)備、人員的檢測(cè)能力等都對(duì)檢測(cè)起到關(guān)鍵的要素。 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及規(guī)劃非常重要，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室的分區(qū)可以減低因污染而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)失敗。

2.1 可以將實(shí)驗(yàn)室分為四個(gè)區(qū)域，各區(qū)功能如下

試劑配制區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制，分裝和保存。需要的設(shè)備有：冰箱、生物安全柜、微量移液器、離心機(jī)。

樣品處理區(qū)：樣品處理和加樣。需要的設(shè)備有：生物安全柜、微量移液器、離心機(jī)、水浴鍋、振蕩器、可移動(dòng)紫外燈、勻漿研磨機(jī)。

核酸提取區(qū)樣品核酸提取。 需要的設(shè)備有：生物安全柜、自動(dòng)核酸提取儀（沒(méi)有這個(gè)儀器也可人工核酸提取）。

核酸擴(kuò)增與分析區(qū)：核酸上機(jī)擴(kuò)增并分析結(jié)果。 需要的設(shè)備有：熒光PCR 儀、UPS 電源（以防止由于電壓的波動(dòng)或停電影響熒光PCR 儀的壽命）、生物安全柜、微量移液器、離心機(jī)2 臺(tái)（一臺(tái)可離心單管、8 聯(lián)管，另一臺(tái)可離心96 孔板）。

2.2 檢驗(yàn)員要求

需要大專以上的獸醫(yī)或微生物相關(guān)專業(yè)，易于了解檢測(cè)對(duì)象的背景；動(dòng)作麻利，有耐心，原則性強(qiáng)的人，能夠嚴(yán)格遵守操作規(guī)程；充分的培訓(xùn)，是得到可靠的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果的前提。

2.3 待檢測(cè)的樣品要符合要求，不能受污染、破損、變質(zhì)等情況

2.4 對(duì)試劑做敏感度的驗(yàn)證

新的試劑與舊的試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較；用已知陽(yáng)性樣本，將樣品進(jìn)行一系列的稀釋。 用新、舊試劑組成的兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，新、舊系統(tǒng)對(duì)同一份樣品的檢測(cè)時(shí)間差異不超過(guò)2h，已保證結(jié)果的可靠性；比較2 種試劑的檢測(cè)結(jié)果差異。

2.5 符合率驗(yàn)證：用不同廠家的檢測(cè)試劑做比對(duì)

2.6 PCR 實(shí)驗(yàn)污染預(yù)防： 嚴(yán)格分區(qū)實(shí)驗(yàn)室及嚴(yán)格遵守工作程序

3 實(shí)時(shí)熒光PCR 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

3.1 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染。實(shí)驗(yàn)中牽涉的有毒有害及有污染的樣本及試劑應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全相關(guān)規(guī)定操作和處理。 在試劑配制區(qū)和樣本處理區(qū)配備負(fù)壓式生物安全柜，以防止對(duì)環(huán)境或?qū)悠返奈廴尽?/p>

3.2 要嚴(yán)格防止氣溶膠交叉污染。不要在生物安全柜以外開(kāi)啟試劑或PCR 管； 禁止在熒光定量PCR 結(jié)束后打開(kāi)PCR 管蓋，反應(yīng)后的PCR 管應(yīng)當(dāng)直接廢棄，切不可在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)開(kāi)啟。

3.3 檢測(cè)試劑使用前在常溫下充分融化并混勻，PCR 反應(yīng)液容易失活，使用時(shí)應(yīng)置于冰盒架上。 嚴(yán)禁使用超過(guò)有效期限的試劑；不同批號(hào)的試劑請(qǐng)匆混用。 試劑打開(kāi)使用后應(yīng)盡快用完。

3.4 所有試劑常溫下融化在開(kāi)啟之前都要瞬時(shí)離心；吸取反應(yīng)液等試劑時(shí)，盡量避免產(chǎn)生氣泡。 熒光探針加完后應(yīng)該盡快避光保存，加入反應(yīng)液后盡快上機(jī)，以防探針粹滅。

3.5 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備時(shí)應(yīng)按陰性對(duì)照、待檢核酸、陽(yáng)性對(duì)照的順序加入PCR 反應(yīng)管中。PCR 管上方不能用記號(hào)筆標(biāo)記；如果是8 聯(lián)排管或96 孔板可在板的邊緣兩端做小的標(biāo)記；PCR 管使用平蓋，96 孔板使用光膜，不要裸手觸摸光蓋或光膜表面；不能帶乳膠手套蓋板或蓋光膜， 手套上有粉末會(huì)影響實(shí)驗(yàn)過(guò)程中光的吸收，可以帶一次性PE 手套來(lái)按壓PCR 反應(yīng)管蓋或光膜。

3.6 上PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確。加樣好的PCR 管要放在離心機(jī)上離心15s秒。 PCR 管或8 聯(lián)排管放置PCR 儀內(nèi)要平衡對(duì)稱。

3.7 檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的吸頭、 離心管等物品應(yīng)放到盛有IO%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測(cè)結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開(kāi)蓋，其他廢棄物品滅菌后做無(wú)害化處理。 檢測(cè)結(jié)束后，立即對(duì)工作臺(tái)清潔。 工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。

綜上所述，把控好非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)關(guān)鍵要素，就能提高工作效率，避免環(huán)境污染；在進(jìn)行熒光PCR 實(shí)驗(yàn)時(shí)把操作注意事項(xiàng)這些細(xì)節(jié)做好，就能提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率和時(shí)效率，避免樣品和試劑對(duì)環(huán)境的污染，也是對(duì)檢測(cè)人員的安全負(fù)責(zé)。 對(duì)每個(gè)細(xì)節(jié)的專注，才能提高檢測(cè)人員的專業(yè)技術(shù)水平。