橙皮素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞PC9發(fā)生凋亡

汪 超，彭萬仁，童斯浩，王 華，施險峰，孫國平

肺癌的死亡率在全球因惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡中位居首位，放、化療對晚期肺癌患者的生存改善不甚顯著，肺癌的病死率依然極高(5年生存率僅為16.8%)[1]。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究的深入，針對肺癌驅(qū)動基因和腫瘤微環(huán)境中免疫抑制分子的靶向干預(yù)藥物正成為肺癌治療的重要方式；但此類靶向藥物的原發(fā)/繼發(fā)性耐藥和高昂的治療成本限制了其在肺癌治療中的應(yīng)用。

橙皮素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]，抑制腫瘤血管生成[2]，減少腫瘤細(xì)胞擴散[3]。目前認(rèn)為，橙皮素介導(dǎo)的抗炎及抗氧化效應(yīng)是其抗腫瘤作用的主要機制[4]，但具體機制尚未完全明確。該研究觀察橙皮素對肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9的增殖及凋亡的影響，并探討其誘導(dǎo)PC9細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與凋亡發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 儀器恒溫CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；雙人單面超凈臺為中國蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；臺式離心機、高速大容量冷凍離心機為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)PC9細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。PC9細(xì)胞使用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞每1～2天進(jìn)行1次換液，細(xì)胞生長密度大于90%時進(jìn)行傳代。凍存細(xì)胞定期進(jìn)行復(fù)蘇，觀察復(fù)蘇細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行生長曲線分析及污染檢測。細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 乳酸脫氫酶(LDH)法檢測細(xì)胞毒性LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。準(zhǔn)備4個96孔板，將PC9細(xì)胞接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度約80%。每個板設(shè)置不同處理孔：單培養(yǎng)基孔(無細(xì)胞)、細(xì)胞對照孔(不加藥物)、細(xì)胞最大酶活性對照孔、藥物處理孔，在各藥物處理孔中加入含有不同濃度(50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)橙皮素的DMEM培養(yǎng)基，分別繼續(xù)培養(yǎng)8、12、24、48 h。取出96孔板在細(xì)胞最大酶活性對照孔中加入LDH釋放試劑，繼續(xù)孵育1 h。收集各孔培養(yǎng)液，離心后取上清120 μl加入新的96孔板。在新孔板各孔中分別加入60 μl LDH檢測工作液，混勻后避光孵育30 min。酶標(biāo)儀測參考波長655 nm，檢測波長490 nm的吸光度值。根據(jù)測定的值計算細(xì)胞毒性：細(xì)胞毒性=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度) / (細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司。將PC9細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度約60%，更換培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度(0、50、100、200、300、400 μmol/L)橙皮素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出6孔板，收集各孔細(xì)胞，消化、離心、洗滌后置于流式管中，使用400 μl 1×Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V染液，振蕩混勻，2～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μl PI染液，2～8 ℃避光孵育5 min。使用流式細(xì)胞儀檢測凋亡。

1.5 Western blot法檢測凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1、Bcl-2、細(xì)胞色素C、CHOP、Caspase-4、Bip、p-JNK、p-Perk、IRE1、ATF6抗體及山羊抗鼠、山羊抗兔二抗均購自美國CST公司。用不同濃度(0、100、200、400 μmol/L)的橙皮素處理PC9細(xì)胞24 h后，消化、離心、洗滌細(xì)胞，并收集細(xì)胞置于1.5 ml EP管中，加入PBS和裂解液，混勻后煮沸15 min。取出EP管置于高速大容量冷凍離心機中離心10 min(4 ℃，12 000 r/min)，取上清液(即蛋白)，BCA法測定蛋白濃度。蛋白可保存于-80 ℃冰箱。蛋白樣品經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上。將PVDF膜置于5% BSA中室溫封閉1 h，TBST洗膜3×10 min，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3×10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3×10 min。在PVDF膜上加入發(fā)光液，于膠片固定在一起，在暗室中顯影。

2 結(jié)果

2.1 橙皮素對人肺腺癌PC9細(xì)胞株殺傷效應(yīng)呈劑量-時間依賴圖1A中可見，在處理時間相同時，隨著藥物處理時間增加，橙皮素對PC9細(xì)胞的殺傷效應(yīng)逐漸增加，與8 h組相比，12、24、48 h組殺傷效應(yīng)明顯增加(P<0.01)。在同一處理時間時，隨著藥物劑量的增大，橙皮素對PC9細(xì)胞的殺傷效應(yīng)逐漸增加，在處理時間為8 h時，與0 μmol/L組相比藥物濃度達(dá)到300 μmol/L時殺傷作用才有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；處理時間為12 h時，與0 μmol/L組相比200 μmol/L時即有明顯殺傷作用(P<0.01)；處理時間為24 h和48 h時，與0 μmol/L組相比100 μmol/L時即有明顯殺傷作用(P<0.01)。表1中所列數(shù)據(jù)為不同濃度橙皮素處理不同時間后的細(xì)胞毒性。圖1B為不同劑量橙皮素處理PC9細(xì)胞48 h后的細(xì)胞光鏡圖，圖中可以看出隨著濃度的增加，活細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞碎片增多。

表1 橙皮素對PC9細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.2 不同劑量橙皮素處理PC9細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)分別使用0、50、100、200、300、400 μmol/L劑量的橙皮素處理PC9細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果可以看出隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，以早期凋亡(Annexin V陽性，PI陰性)細(xì)胞增多為主(圖2A)。圖2B為總凋亡率的統(tǒng)計分析，0、50、100、200、300、400 μmol/L組凋亡細(xì)胞比例依次為：(0.08±0.06)、(6.86±1.38)、(14.50±1.62)、(17.65±2.36)、(23.43±3.55)、(32.03±2.91)，50 μmol/L的橙皮素即可明顯誘導(dǎo)PC9細(xì)胞的凋亡(F=75.56，P<0.05)。

2.3 橙皮素處理PC9細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白的變化采用Western blot法檢測不同劑量橙皮素處理后PC9細(xì)胞凋亡相關(guān)通路中的蛋白水平變化。圖3A中可見，活化的Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1、細(xì)胞色素C的條帶隨著藥物濃度的增加逐漸增粗，Bcl-2條帶逐漸變細(xì)。圖3B統(tǒng)計中在橙皮素濃度為0、100、200、400 μmol/L時，活化Caspase-3蛋白水平相對Actin比率分別為(0.31±0.05)、(0.57±0.05)、(0.75±0.08)、(0.87±0.07)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.08，P<0.05)；活化Caspase-9相對比率分別為(0.74±0.07)、(0.76±0.07)、(0.92±0.09)、(1.01±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.07，P<0.05)；細(xì)胞色素C相對比率分別為(0.26±0.04)、(0.31±0.04)、(0.32±0.05)、(0.57±0.08)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.73，P<0.05)；Apaf-1相對比率分別為(1.31±0.06)、(1.43±0.11)、(1.51±0.19)、(1.75±0.11)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.427，P<0.05)。Caspase-3、Caspase-9、細(xì)胞色素C、Apaf-1水平在橙皮素處理后均上調(diào)；而橙皮素濃度處理后Bcl-2水平明顯降低，藥物濃度為0、100、200、400 μmol/L時相對比率分別為(2.43±0.11)、(1.36±0.13)、(0.91±0.08)、(0.61±0.10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=175.5，P<0.05)。

2.4 橙皮素處理PC9細(xì)胞后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白的變化在不同濃度橙皮素處理PC9細(xì)胞后，使用Western blot法檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白(CHOP、Caspase-4、Bip和p-JNK)的表達(dá)水平。圖4 A顯示在橙皮素濃度分別為0、100、200和400 μmol/L 時，CHOP、Caspase-4、Bip和p-JNK這4個蛋白的條帶呈增粗趨勢。圖4B統(tǒng)計顯示，CHOP、Caspase-4、Bip和p-JNK蛋白表達(dá)水平在橙皮素處理后均上調(diào)，在橙皮素處理濃度為0、100、200和400 μmol/L時相對比率分別為CHOP：(0.68±0.05)、(0.68±0.08)、(1.05±0.13)、(1.11±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.33，P<0.05)；Caspase-4：(0.16±0.02)、(0.28±0.02)、(0.43±0.05)、(0.58±0.07)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=50.92，P<0.05)；Bip：(0.42±0.06)、(0.5±0.06)、(0.67±0.07)、(1.04±0.11)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=37.23，P<0.05)；p-JNK：(0.76±0.09)、(1.14±0.09)、(1.31±0.15)、(1.51±0.16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.77，P<0.05)。

圖1 橙皮素對PC9細(xì)胞的細(xì)胞毒性隨劑量和時間變化 ×200

A：橙皮素對PC9細(xì)胞的細(xì)胞毒性隨劑量和時間變化；與8 h組相比，**P<0.01，與0 μmol/L組相比，##P<0.01；B：不同濃度處理PC9細(xì)胞48 h光鏡圖；1：0 μmol/L；2：50 μmol/L；3：100 μmol/L；4：200 μmol/L；5：300 μmol/L；6：400 μmol/L；7：500 μmol/L；8：600 μmol/L

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測PC9細(xì)胞凋亡

圖3 Western blot檢測PC9細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平

1:Activated Caspase-3;2:Activated Caspase-9;3:Bcl-2;4:Apaf-1;5:細(xì)胞色素C, 與0 μmol/L組相比：*P<0.05，**P<0.01

2.5 橙皮素處理PC9細(xì)胞后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中感受器蛋白水平變化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中，除相關(guān)蛋白外，還檢測了相關(guān)感受器蛋白p-Perk、IRE1和c-ATF6的水平。圖5A中p-Perk、IRE1及c-ATF6的剪切體水平均隨橙皮素濃度增大而升高。圖5B統(tǒng)計圖顯示，p-Perk、IRE1和c-ATF6蛋白水平在橙皮素處理后明顯增高。在橙皮素處理濃度為0、100、200和400 μmol/L時，p-Perk表達(dá)相對比率分別為(0.43±0.05)、(0.71±0.07)、(1.2±0.13)、(1.26±0.1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=55.11，P<0.05)；IRE1相對比率分別為(0.45±0.04)、(0.64±0.08)、(0.82±0.08)、(0.94±0.1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.55，P<0.05)；c-ATF6相對比率分別為(0.04±0.003)、(0.07±0.01)、(0.12±0.01)、(0.34±0.04)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=109.4，P<0.05)。

3 討論

流行病學(xué)研究[5]表明，蔬菜、水果的日常攝取量和腫瘤等慢性疾病發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。其中富含的黃酮類化合物被廣泛應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防及化療中的輔助用藥。作為柑橘類水果中含量最豐富的黃酮類化合物，橙皮素被證實在體外可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡及細(xì)胞周期阻滯[6]。本實驗中，橙皮素在體外可顯著抑制人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9的增殖，且此抑制效應(yīng)為時間-劑量依賴性。試驗中50 μmol/L橙皮素處理即可顯著誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生凋亡，橙皮素誘導(dǎo)的凋亡被認(rèn)為和其誘導(dǎo)的靶細(xì)胞線粒體膜滲透性改變相關(guān)。Bcl-2家族蛋白是決定線粒體滲透的主要效應(yīng)蛋白，當(dāng)Bcl-2/Bax蛋白比例降低，線粒體膜的穩(wěn)定性下降、通透性升高，線粒體內(nèi)促凋亡因子如細(xì)胞色素C等釋放至胞漿內(nèi)，結(jié)合Apaf-1后繼而招募、活化Caspase9/3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。本實驗中，隨著橙皮素處理濃度的升高和凋亡程度增多，PC9細(xì)胞中Caspase-9、Caspase-3、Apaf-1以及細(xì)胞色素C的表達(dá)水平均顯著升高，伴隨Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，證實橙皮素通過誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激啟動PC9細(xì)胞凋亡。

圖4 Western blot檢測PC9細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白

圖5 Western blot檢測PC9細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)感受器蛋白

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對氧化應(yīng)激反應(yīng)、射線損傷、血糖升高及異常蛋白堆積等異常因素的一種保護(hù)性反應(yīng)，旨在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持相對穩(wěn)態(tài)而免于發(fā)生凋亡。目前認(rèn)為，ER stress和線粒體應(yīng)激相互關(guān)聯(lián)。在特定的細(xì)胞類型中，線粒體誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生很大程度上需要ER stress參與，稱為ER stress依賴的凋亡[8]。ER stress的發(fā)生和未折疊蛋白積聚有關(guān)，p-Perk、IRE1及c-ATF6是介導(dǎo)ER stress發(fā)生的主要信號通路[9]。p-Perk可以介導(dǎo)eIF2α磷酸化，進(jìn)而抑制胞內(nèi)蛋白合成，降低ER stress的強度，避免誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[10]。Bip(又名GRP-78)在細(xì)胞發(fā)生ER stress時表達(dá)量亦會上調(diào)，其主要功能是作為分子伴侶協(xié)助未折疊蛋白進(jìn)行正確折疊，降低ER腔內(nèi)蛋白堆積程度，下調(diào)ER stress強度[11]。但eIF2α的活化會增加CHOP分子表達(dá)，而CHOP是可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的?？梢奅R stress是一個動態(tài)變化的過程，其結(jié)局是協(xié)助細(xì)胞對抗應(yīng)激存活或是(聯(lián)合線粒體應(yīng)激)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，取決于ER stress的強度和持續(xù)時間[12]。本實驗中，PC9細(xì)胞中p-Perk、IRE1及c-ATF6在接受橙皮素處理后均顯著上調(diào)，可見ER stress效應(yīng)分子Bip及CHOP的表達(dá)增加，提示橙皮素可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生ER stress。IRE1和Perk可以激活JNK通路，尤其是ER stress程度加劇時，JNK的活化可以加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程[13]。本研究中，橙皮素處理可以明顯上調(diào)PC9細(xì)胞JNK表達(dá)水平，伴隨ER stress中Caspase 4表達(dá)增加。以上結(jié)果均提示，橙皮素誘導(dǎo)PC9發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體聯(lián)合應(yīng)激，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。