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    SSR 技術(shù)在果樹上的應(yīng)用

    2020-02-13 07:31:38張慶祥
    江西農(nóng)業(yè) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:微衛(wèi)星種質(zhì)果樹

    羅 球 張慶祥

    (江西省撫州市臨川區(qū)茅排鄉(xiāng)政府,江西撫州 344100)

    簡單重復(fù)序列(SSR)是由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列,這些序列具有保守性,在生物基因組中大量存在。大量實(shí)踐結(jié)果表明,SSR 更容易被檢測出來,在果樹研究方面得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。

    1 SSR 技術(shù)的概述

    1.1 技術(shù)原理 對(duì)于SSR 兩端的序列來說,普遍為保守程度較高的單拷貝序列,基于此能夠完成一對(duì)特異引物的構(gòu)建,以此完成SSR-PCR,并實(shí)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列的擴(kuò)增。在電泳的支持下檢測擴(kuò)增段的多態(tài)性現(xiàn)象,即實(shí)現(xiàn)SSR 標(biāo)記。在當(dāng)前的分析中,一般使用串聯(lián)重復(fù)數(shù)的差異性完成相應(yīng)的遺傳分析,并實(shí)現(xiàn)對(duì)微衛(wèi)星DNA 長度多態(tài)性的顯現(xiàn)。

    1.2 技術(shù)特點(diǎn) 對(duì)于SSR 技術(shù)來說,其在實(shí)際的應(yīng)用中主要表現(xiàn)出以下特點(diǎn)。①SSR 的數(shù)量很多,普遍可以覆蓋整個(gè)染色體組。②具有明顯的多等位基因特性,因此富含的信息量更多。③在使用中遵循孟德爾遺傳定律,呈現(xiàn)出共顯性的特征。④在實(shí)際的使用中對(duì)DNA 數(shù)量以及純度的要求較低,更容易實(shí)現(xiàn)PCR 分析,且分析結(jié)果具備更優(yōu)的重復(fù)性。⑤引物序列的順序完成,為實(shí)現(xiàn)交換提供更好的支持。

    1.3 技術(shù)優(yōu)勢

    1.3.1 SSR 技術(shù)與RFLP 標(biāo)記技術(shù) RFLP 標(biāo)記技術(shù)是發(fā)展最早的DNA 標(biāo)記技術(shù),在使用中需要利用限制性內(nèi)切酶酶切DNA,并使用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA 片段。相較于RFLP 技術(shù)來說,SSR 技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的操作流程更為簡單,且分析速度更快、多態(tài)性更強(qiáng),同時(shí)可以完成基因組串聯(lián)重復(fù)序列的檢測,這是RFLP 技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的,因此SSR 技術(shù)有著更高的應(yīng)用價(jià)值。

    1.3.2 SSR 技術(shù)與RAPD 技術(shù) RAPD 技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種分析技術(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析。相較于RAPD 技術(shù)來說,SSR 技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中具有更強(qiáng)的重復(fù)性與穩(wěn)定性,在分析結(jié)果的比較中發(fā)揮出了更好的作用。

    總體而言,SSR 技術(shù)包含RFLP 技術(shù)以及RAPD 技術(shù)的優(yōu)勢,且可在較短時(shí)間內(nèi)完成大規(guī)模的樣本分析,實(shí)用性更強(qiáng),能夠彌補(bǔ)后兩種技術(shù)的不足,因此有著更廣闊的應(yīng)用前景。

    2 SSR 技術(shù)的應(yīng)用步驟分析

    在實(shí)際的應(yīng)用中,SSR 標(biāo)記的分析步驟可以總結(jié)為兩步,即微衛(wèi)星引物的獲取與設(shè)計(jì)、SSR-PCR 擴(kuò)增與檢測。

    2.1 微衛(wèi)星引物的獲取與設(shè)計(jì) 該步驟可以進(jìn)一步細(xì)化為獲取引物、使用近緣種引物、引物設(shè)計(jì)3 個(gè)環(huán)節(jié)。其中,在獲取引物中,可以提取所研究對(duì)象的已知SSR 兩翼序列/引物,或者在公共DNA 序列數(shù)據(jù)庫中提取。對(duì)于使用近緣種引物來說,由于屬內(nèi)種間和SSR 位點(diǎn)序列基本保守,因此有著較高的可行性。在引物設(shè)計(jì)中,可以依托同一物種間微衛(wèi)星兩側(cè)序列的保守程度高這一規(guī)律完成,從而達(dá)到同一物種(甚至可以為不同物種)其他基因型微衛(wèi)星片段的擴(kuò)增。在此環(huán)節(jié)中,需要構(gòu)建基因組DNA 文庫。

    2.2 SSR-PCR 擴(kuò)增與檢測 在SSR 技術(shù)的應(yīng)用中,因?yàn)槭褂昧颂禺愋詳U(kuò)增,所以擴(kuò)增的穩(wěn)定性更好。需要注意的是,在不同引物中,(G+C)%含量存在一定的差異,且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度也有所不同,所以應(yīng)當(dāng)針對(duì)所有引物設(shè)定擴(kuò)條件。同時(shí),處于對(duì)結(jié)果明顯性、準(zhǔn)確性的考量,必須使用具備加高分辨率的聚丙酰胺凝膠電泳,并在實(shí)際擴(kuò)增過程中投入包含放射性標(biāo)記的dNTP,以確保顯示結(jié)果的質(zhì)量。

    3 SSR 技術(shù)在果樹上的應(yīng)用

    3.1 在果樹種質(zhì)資源研究方面的應(yīng)用 從當(dāng)前的情況來看,在果樹種質(zhì)資源研究方面,SSR 技術(shù)主要被應(yīng)用于鑒別品種真實(shí)性上,以此達(dá)到避免遺傳漂變、外來劃分授粉等問題的效果。同時(shí),SSR 技術(shù)還被應(yīng)用于研究個(gè)體與群體之間的近緣程度,實(shí)現(xiàn)個(gè)體遺傳構(gòu)成的分析,并對(duì)群體內(nèi)的變異進(jìn)行區(qū)分。例如,使用SSR 技術(shù)展開多個(gè)葡萄品種、品系的鑒定,能夠辨別出其中具備相同擴(kuò)增片段的品種,并將其與其他品種進(jìn)行區(qū)別。在SSR 技術(shù)的支持下,還可以實(shí)現(xiàn)釀酒葡萄品種品本的鑒定。當(dāng)前,在柑橘珠心苗的研究中,SSR 技術(shù)被應(yīng)用在種質(zhì)鑒定方面,并取得了一定的成效。總體來說,SSR 技術(shù)在種質(zhì)資源的收集、保存、評(píng)價(jià)與利用中均發(fā)揮了極高的應(yīng)用價(jià)值。

    在核果類果樹種質(zhì)資源的遺傳分析中,SSR 技術(shù)的應(yīng)用為種質(zhì)資源研究及品種鑒定提供了技術(shù)支持,從這一角度來說,在農(nóng)藝性狀標(biāo)記方面,SSR 技術(shù)能夠充分發(fā)揮作用。使用SSR 技術(shù)分析桃種間的親緣關(guān)系能夠發(fā)現(xiàn),部分桃種間存在親緣關(guān)系,例如新疆桃與普通桃、甘肅桃與陜西桃等。在此基礎(chǔ)上,還可以獲取桃間的演化模式,為分子標(biāo)記輔助育種在桃栽植方面的有效應(yīng)用提供支持。

    對(duì)于SSR 技術(shù)來說,其還可以應(yīng)用于跨種、跨屬的種質(zhì)資源研究。例如,利用SSR 技術(shù)可以明確柿屬植物分子進(jìn)化以及系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)內(nèi)容;利用SSR 技術(shù)分析果梅種質(zhì)資源的遺傳多樣性,可以明確PCR 反應(yīng)體系的主要成分,結(jié)合對(duì)已知微衛(wèi)星序列展開同源性分析以及抗寒性鑒定(性能鑒定),能夠完成優(yōu)質(zhì)梅種質(zhì)的篩選。

    3.2 在構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜方面的應(yīng)用 在當(dāng)前技術(shù)水平條件下,分子標(biāo)記遺傳圖譜的主要構(gòu)建技術(shù)為SSR 技術(shù)。對(duì)于果樹來說,其雜合程度較高、生長周期更長,且部分果樹存在孤雌生殖的特點(diǎn),因此利用構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜完成標(biāo)記、定位、克隆經(jīng)濟(jì)形狀具有極高的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。目前,世界范圍內(nèi)已經(jīng)完成了超過500 個(gè)由SSR 標(biāo)記構(gòu)成的水稻分子連鎖圖,平均長度達(dá)到3.6 cm。

    目前,農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展使得果樹研究成果頻出,構(gòu)建果樹分子標(biāo)記遺傳圖譜的速度也越來越快。在當(dāng)前的研究中,已經(jīng)構(gòu)建櫻桃、李子、桃等多種果樹種的遺傳連鎖圖譜,其中,普遍使用了SSR 技術(shù)進(jìn)行輔助標(biāo)記,核心技術(shù)為RFLP 技術(shù)。例如,依托存在于柑橘基因組文庫中的多對(duì)SSR 引物,補(bǔ)充已知柑橘遺傳圖譜(構(gòu)建方法為同工酶方法與RFLP 技術(shù)),實(shí)現(xiàn)了2 個(gè)連鎖圖的新增,其中包含8 個(gè)標(biāo)記。在構(gòu)建葡萄遺傳連鎖圖的過程中,應(yīng)用SSR 技術(shù)以及CAPS,可以得出某SSR 分子標(biāo)記與性別基因呈現(xiàn)出相對(duì)緊密的連鎖狀態(tài),結(jié)合QTL 定位法能夠進(jìn)一步獲得與抗病基因保持連鎖狀態(tài)的分子標(biāo)記,為葡萄品種及其優(yōu)化提供支持。

    4 結(jié)語

    相比于RFLP 標(biāo)記技術(shù)以及RAPD 技術(shù),SSR 技術(shù)擁有兩者的優(yōu)勢,能夠彌補(bǔ)后兩種技術(shù)的不足,且可在較短時(shí)間內(nèi)完成大規(guī)模的樣本分析,實(shí)用性更強(qiáng),因此擁有更為廣闊的應(yīng)用前景。在當(dāng)前的果樹研究中,SSR 技術(shù)主要被應(yīng)用在果樹種質(zhì)資源研究方面以及構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜方面,且取得了很多研究成果,值得重點(diǎn)關(guān)注與探究。

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