代謝組學(xué)技術(shù)及其在部分寄生原蟲研究中的應(yīng)用

姜曉明,張 聰,趙佳琪,馮憲敏,馬愛新,孔繁利*

(1.北華大學(xué)，吉林 吉林 132013;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

在1999年Nicholson[1]和2000年Fiehn[2]在分別提出代謝組學(xué)的概念后，有關(guān)于代謝組學(xué)研究逐漸進(jìn)入到各種研究領(lǐng)域，并逐漸成為各研究機(jī)構(gòu)的研究熱點(diǎn)。代謝組學(xué)通過(guò)研究生物在新陳代謝的程中代謝產(chǎn)物的變化從而揭示其代謝途徑及代謝機(jī)制等。代謝組是一個(gè)生物體或其一個(gè)器官甚至一個(gè)細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物，其分子量較小，這些分子通常在生物體生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物效應(yīng)[3]。

1 代謝組學(xué)技術(shù)

目前對(duì)于代謝組學(xué)的研究過(guò)程的方法一般包括三個(gè)方面，即對(duì)樣品處理、處理樣本后的檢測(cè)以及對(duì)于檢測(cè)的數(shù)據(jù)分析[4]。

1.1 樣本處理技術(shù)

代謝組學(xué)的樣本最為常用的為血液和尿液，在科學(xué)研究中組織和細(xì)胞(蟲體)培養(yǎng)液也是其檢測(cè)的樣本。為了去除雜質(zhì)代謝物采樣后一般要求對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理[5]。目前代謝組學(xué)樣品的預(yù)處理方法較多，常見的有液-液萃取、固相萃取(SEP)等。因SEP法能夠獲得到一些特殊的代謝產(chǎn)物，而其他方法一般不能達(dá)到此效果，所以SPE法是目前使用最多的處理樣本方法[6]。

1.2 樣本檢測(cè)分析技術(shù)

對(duì)于樣本的檢測(cè)目前應(yīng)用的技術(shù)主要包括質(zhì)譜技術(shù)(MS)、核磁共振技術(shù)(NMR)及氣相色譜技術(shù)GC和液相色譜技術(shù)LC等。而NMR和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)是其最常用的技術(shù)[7]。其他新型的技術(shù)。在某些研究報(bào)道中也有應(yīng)用。

1.2.1核磁共振技術(shù)

NMR技術(shù)應(yīng)用廣泛其優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，對(duì)樣本無(wú)破壞性[8]，不需要分離樣本[9]。這些優(yōu)點(diǎn)使其成為對(duì)整個(gè)有機(jī)體體內(nèi)原位研究代謝組學(xué)檢測(cè)的好方法。其缺點(diǎn)是靈敏度較低，這也限制了其應(yīng)用[5]。近年來(lái)，隨著高分辨率核磁共振技術(shù)的發(fā)展，使其靈敏度低的不足得到改善[10]。

1.2.2色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

GC-MS的缺點(diǎn)是其樣品必需易揮發(fā)[5]。分辨率高、分析時(shí)間短的全二維氣相色譜(GC×GC)的應(yīng)用彌補(bǔ)了其缺陷[11]。LC-MS靈敏度高，其痕量分析代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)，使其在代謝組學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用[12]。高效液相色譜法(UPLC)和質(zhì)譜MS聯(lián)用(UPLC-MS)提高了分辨率和重復(fù)性，未來(lái)被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)的潛力巨大[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

代謝組學(xué)采集的數(shù)據(jù)量龐大，常規(guī)的統(tǒng)計(jì)分析方法不適用于其分析[14]。因此需要應(yīng)用生物信息學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)數(shù)據(jù)分析處理，稱為模式識(shí)別技術(shù)，具體方法包含非監(jiān)督(unsupervised)方法和有監(jiān)督(supervised)方法兩種[15]。非監(jiān)督方法是用主成分分析(PCA)[16]、聚類分析(HCA)[17]等方法將原始數(shù)據(jù)歸類后可視化的展示。而有監(jiān)督方法的基礎(chǔ)是建模,在建模的基礎(chǔ)上用已知樣本和信息對(duì)未知數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類分析的方法。應(yīng)用最廣泛的有監(jiān)督方法是偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)[18]。因?yàn)橛斜O(jiān)督方法在分析前需要進(jìn)行假設(shè)，因此假設(shè)的合理性關(guān)乎最后結(jié)果，至關(guān)重要。

2 代謝組學(xué)在一些寄生原蟲研究中的應(yīng)用

2.1 惡性瘧原蟲

惡性瘧原蟲為寄生于人體的四種瘧原蟲之一，是造成惡性瘧疾的病原體。惡性瘧疾并發(fā)癥較多，可危及生命。其致病階段為其紅細(xì)胞內(nèi)期的裂體增殖期[19]。此時(shí)宿主細(xì)胞代謝會(huì)出現(xiàn)異常[20]。Olszewski等[21]利用LC-MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)其糖酵解與三羧酸循環(huán)沒有相關(guān)性，另外三羧酸循環(huán)在惡性瘧原蟲出現(xiàn)出分支化的現(xiàn)象。Orikiiriza等[22]利用1H NMR技術(shù)對(duì)惡性瘧原蟲患者血漿進(jìn)行檢測(cè)，其宿主脂代謝發(fā)生紊亂。Sengupta等[23]用同樣的方法發(fā)現(xiàn)了腦性瘧原蟲病的宿主體內(nèi)糖蛋白含量出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。

2.2 枯氏錐蟲

枯氏錐蟲的傳播媒介是錐蝽[24]，在錐蝽的消化道內(nèi)寄生著錐蟲[25]。有團(tuán)隊(duì)用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析了三種不同的錐蝽的代謝，發(fā)現(xiàn)代謝圖譜中近80%是相近的，不同的為脂質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、類固醇、酚類等[26]。Trochin等[27]用HPLC-MS技術(shù)對(duì)枯氏錐蟲進(jìn)行了代謝組學(xué)分析時(shí)加入了藥物處理，經(jīng)處理后錐蟲的硫醇類化合物的水平下降了，濃度升高的是堿基濃度。相似的實(shí)驗(yàn)中，Vincent等又發(fā)現(xiàn)糖酵解的過(guò)程受到了抑制[28]。

2.3 利士曼原蟲

利士曼原蟲可引起黑熱病，其傳播媒介為白蛉[29]。Canuto等[30]同時(shí)用了GC-MS、LC-MS和CE-MS對(duì)蟲體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)活性氧的產(chǎn)量升高時(shí)聚胺代謝受到了抑制。此原蟲前鞭毛體能夠大量累積葡萄糖，可在無(wú)糖時(shí)生存。吸收葡萄糖時(shí)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮重要作用，但是敲除此蛋白后，蟲體仍可存活，其感染能力下降[31]。同時(shí)，當(dāng)蟲體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被敲除，會(huì)導(dǎo)致蟲體的多種糖代謝水平降低[32]。

2.4 剛地弓形蟲

剛地弓形蟲是嚴(yán)格的宿主細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，所有生存所需的營(yíng)養(yǎng)全部來(lái)自于宿主細(xì)胞[33]。以往認(rèn)為宿主葡萄糖是其能量唯一來(lái)源，但當(dāng)敲除其吸收葡萄糖功能的基因后仍可生存[34]。James等[35]使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了代謝分析。發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)γ氨基丁酸分流的方式分解谷氨酰胺以獲得能量。有團(tuán)隊(duì)研究弓形蟲感染會(huì)引起宿主代謝的變化，發(fā)現(xiàn)感染弓形蟲的小鼠體內(nèi)多巴胺含量都增多[36]。弓形蟲感染還可以影響犬類的尿氨酸代謝通路[37],隨著感染的開始代謝物含量上升，應(yīng)用藥物治療后，代謝物含量下降。

代謝組學(xué)以及其他新興的技術(shù)是研究寄生蟲和寄生蟲病的強(qiáng)有力手段。寄生蟲與其宿主之間存在太多已知和未知的錯(cuò)綜代謝關(guān)聯(lián)與影響，而代謝組學(xué)則能夠從本質(zhì)上揭示寄生蟲病的發(fā)生機(jī)制。廣泛及有效地利用這些研究手段，去發(fā)現(xiàn)其機(jī)制、研發(fā)新疫苗、改良現(xiàn)有的藥物是科研人員義不容辭的責(zé)任。