紫草素對(duì)人白血病MV4-11細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用

蘇 龍，張?jiān)莆担?卓，宋 飛，秦田雪，高素君

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心血液科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者FMS樣酪氨酸激酶3受體基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列(FMS-like tyrosine kinase-3 receptorinternal tandem duplication, FLT3-ITD)突變的發(fā)生率為20%～30%，F(xiàn)LT3-ITD突變AML危險(xiǎn)分層屬于高危組，預(yù)后不良[1-3]。微小RNA(microRNAs)在髓細(xì)胞分化和白血病發(fā)生中均發(fā)揮十分重要的作用，microRNA-155(miR-155)是AML的不良預(yù)后指標(biāo)之一[4]。在FLT3-ITD突變AML患者中， miR-155表達(dá)明顯上調(diào)[5]。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道：通過靶向藥物干擾miR-155表達(dá)，可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡且能夠延長(zhǎng)白血病小鼠的生存期。miR-155可能是FLT3-ITD突變AML的理想治療靶點(diǎn)之一。盡管紫草素的抗腫瘤作用在實(shí)體腫瘤中被廣泛報(bào)道，但有關(guān)其抗白血病作用的研究[7-9]較少。紫草素對(duì)FLT3-ITD突變AML是否有作用目前尚不清楚，且紫草素對(duì)miR-155表達(dá)是否有影響亦無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用人FLT3-ITD突變AML MV4-11細(xì)胞為研究對(duì)象，探討紫草素對(duì)其增殖抑制和促凋亡作用，初步闡明其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 MV4-11細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(美國(guó)Gemini公司)和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)賽默飛世爾公司)中。紫草素購(gòu)自上海純優(yōu)生物有限公司，采用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成10 g·L-1儲(chǔ)存液備用。CCK-8試劑盒(上海東仁化學(xué)科技有限公司)，Annexin Ⅴ-FITC/7-AAD試劑盒(美國(guó)BD公司)，RNAiso Plus試劑盒[寶生物(大連)有限公司]，miRcute miRNA提取分離試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，Real-time PCR試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾公司)。流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MV4-11細(xì)胞，在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液(調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL-1)。MV4-11細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0和 8.0 μmol·L-1)紫草素處理24和 48 h，同時(shí)設(shè)不加紫草素的DMSO組作為對(duì)照，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)值。每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算24和 48 h 時(shí)紫草素的半數(shù)抑制濃度(IC50)。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)] × 100%。

1.3 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CSFE)標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MV4-11細(xì)胞，采用CFSE預(yù)孵育8 min。在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液(調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL-1)。MV4-11細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0.25、0.50和1.00 μmol·L-1)紫草素處理48 和72 h，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和DMSO組。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CFSE標(biāo)記細(xì)胞百分率，即細(xì)胞增殖率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 采用不同濃度(1/2×IC50、IC50和2×IC50)紫草素處理MV4-11細(xì)胞24～48 h，同時(shí)設(shè)不加紫草素的DMSO組作為對(duì)照。收集用于凋亡檢測(cè)的細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，去除培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，加入Anexin Ⅴ-FITC 5 μL 和7-AAD 5 μL，輕柔彈起混勻，4℃避光孵育30 min。1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平 MV4-11細(xì)胞分為DMSO組和不同濃度(1/4×IC50、1/2×IC50和IC50)紫草素組，處理48 h后，采用RNAiso Plus試劑盒和miRcute miRNA提取分離試劑盒提取總RNA，具體操作參照說明書。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用Real-time PCR試劑盒檢測(cè)基因表達(dá)，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相關(guān)引物序列如下：Human U6，F(xiàn) 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R 5′-AACGCTTCACGAA-

TTTGCGT-3′；miR-155，F(xiàn) 5′-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3′， R 5′-GCTGTCAACG-

ATACGCTACCTA-3′。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率和增殖率 采用不同濃度紫草素(0.5～8.0 μmol·L-1)處理MV4-11細(xì)胞24～48 h，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示：與DMSO組比較，不同濃度紫草素組MV4-11細(xì)胞的增殖抑制率明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且隨著紫草素濃度的升高各組細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(表1)。根據(jù)不同濃度紫草素組細(xì)胞的增殖抑制率結(jié)果計(jì)算，24和48 h時(shí)紫草素的IC50分別為1.743 (1.468～2.118) μmol·L-1和1.404 (1.228～1.612) μmol·L-1。不同濃度紫草素(0.25、0.50和1.00 μmol·L-1)處理MV4-11細(xì)胞48和72 h，采用CFSE標(biāo)記法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組和DMSO組比較，不同濃度紫草素組細(xì)胞增殖率均明顯降低。見圖1。

表1 不同濃度紫草素作用24和48 h時(shí)各組MV4-11細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of MV4-11 cells in various groups after treated with different concentrations of shikonin for 24 and 48 h

*P<0.05,**P<0.01 compared with DMSO group.

2.2 各組細(xì)胞凋亡率 作用48 h時(shí)紫草素的IC50為1.404 μmol·L-1。MV4-11細(xì)胞經(jīng)不同濃度[0.702(1/2×IC50)、1.404(IC50)和2.808 μmol·L-1(2×IC50)]紫草素處理48 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示： DMSO組和紫草素0.702、1.404及2.808 μmol·L-1紫草素組細(xì)胞凋亡率分別為(7.96 ± 1.39)%、(11.33 ± 4.28)%、(21.02 ± 3.59)%和(23.65 ± 2.65)%，與DMSO組比較，不同濃度紫草素組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見圖2。

2.3 各組細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平 不同濃度紫草素處理MV4-11細(xì)胞48 h，采用Real-time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與DMSO組比較， 0.702和1.404 μmol·L-1紫草素組細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)； 1.404 μmol·L-1紫草素組細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平降低超過75%。見圖3。

A-E: 48 h; F-J: 72 h; A, F: Blank control group; B, G: DMSO group; C, H: 0.25 μmol·L-1shikonin group; D, I: 0.50 μmol·L-1shikonin group; E, J: 1.00 μmol·L-1shikonin group.
圖1 CFSE法檢測(cè)各組MV4-11細(xì)胞增殖率
Fig.1 Proliferation rates of MV4-11 cells in various groups determined by CFSE method

A: DMSO group；B: 0.702 μmol·L-1 shikonin group；C: 1.404 μmol·L-1 shikonin group；D: 2.808 μmol·L-1 shikonin group.圖2 不同濃度紫草素作用48 h時(shí)各組MV4-11細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of MV4-11 cells in various groups after treated with different concentrations of shikonin for 48 h

*P<0.01 compared with DMSO group.A: DMSO group; B: 0.351 μmol·L-1shikonin group; C: 0.702 μmol·L-1shikonin group; D: 1.404 μmol·L-1shikonin group.
圖3 不同濃度紫草素作用48 h時(shí)各組MV4-11細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平
Fig.3 Expression levels of miR-155 in MV4-11 cells in various groups after treated with different concentrations of shikonin for 48 h

3 討 論

FLT3-ITD突變是AML最常見的基因突變，為AML的不良預(yù)后分子標(biāo)志之一。與野生型患者比較，F(xiàn)LT3-ITD突變患者具有骨髓原始細(xì)胞高、外周血白細(xì)胞高、初始誘導(dǎo)治療緩解率低、早期死亡率高和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高等特點(diǎn)，采用聯(lián)合化療患者長(zhǎng)期存活率僅為20%～30%[10-12]。異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)是目前唯一有望徹底治愈FLT3-ITD突變AML患者的治療手段。多項(xiàng)研究[13-14]顯示：FLT3-ITD突變是接受allo-HSCT患者的不良預(yù)后指標(biāo)之一，與野生型患者比較，F(xiàn)LT3-ITD突變患者allo-HSCT后復(fù)發(fā)率更高且存活期更短。但也有研究[15-17]報(bào)道：FLT3-ITD突變對(duì)allo-HSCT后患者預(yù)后無明顯影響。上述研究結(jié)果的差異可能與預(yù)處理方案、移植類型和移植后搶先干預(yù)手段等不同有關(guān)。因此，allo-HSCT是否可逆轉(zhuǎn)FLT3-ITD突變AML患者的不良預(yù)后尚存在一定爭(zhēng)議。近年來靶向藥物在治療FLT3-ITD突變AML患者治療中取得一定進(jìn)展[18]。2017年《新英格蘭雜志》報(bào)道了應(yīng)用米哚托林治療FLT3-ITD突變AML患者臨床試驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)果顯示：米哚托林組患者4年的無疾病生存率和總生存率分別為51.4%和28.2%，安慰劑組為44.3%和20.6%[19]。盡管患者可以從米哚托林治療中獲益，該藥也已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療FLT3-ITD突變AML患者，但目前國(guó)內(nèi)患者無法使用且療效改善仍有限。FLT3-ITD突變AML患者的治療仍有待改善。

FLT3-ITD突變可導(dǎo)致受體持續(xù)活化，進(jìn)而激活一系列下游信號(hào)分子，如核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，后者可通過結(jié)合miR-155的啟動(dòng)子進(jìn)而上調(diào)miR-155表達(dá)；miR-155可抑制SHIP1、PU.1和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白A(CEBPA)表達(dá)，SHIP1是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的抑制物，而PU.1和CEBPA是髓細(xì)胞分化過程中十分重要的轉(zhuǎn)錄因子。因此，F(xiàn)LT3-ITD突變可導(dǎo)致造血細(xì)胞分化受阻并大量增殖，并最終形成急性白血病[5]。多項(xiàng)研究[4, 20-21]表明：FLT3-ITD突變AML患者miR-155表達(dá)水平明顯升高，且為AML的不良預(yù)后因素之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]表明：抑制白血病小鼠miR-155表達(dá)可明顯延長(zhǎng)小鼠的生存期。因此，調(diào)控miR-155可能是治療FLT3-ITD突變患者的重要策略之一。

已有研究[7-9]報(bào)道：紫草素具有抗白血病效應(yīng)。紫草素可通過含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)途徑誘導(dǎo)人類急性早幼粒細(xì)胞白血病HL60細(xì)胞系凋亡[7]。在BCR-ABL陽性慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中，紫草素可通過活性氧(reactive oxygen species,ROS)/ c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。近來有研究[9]報(bào)道了紫草素殺傷U937白血病細(xì)胞的新機(jī)制，紫草素可能通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/JNK/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和AKT通路抑制c-MYC基因進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，紫草素對(duì)人FLT3-ITD突變AML細(xì)胞系是否有作用目前并不清楚。本研究結(jié)果顯示：紫草素對(duì)MV4-11細(xì)胞系具有明顯的增殖抑制作用和促凋亡作用，紫草素可明顯下調(diào)MV4-11細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平。NF-κB通過結(jié)合miR-155啟動(dòng)子進(jìn)而調(diào)節(jié)miR-155表達(dá)[15]。既往研究[22-23]報(bào)道：紫草素通過NF-κB發(fā)揮其主要生物學(xué)功能。因此，本文作者推測(cè)：紫草素可能通過抑制NF-κB入核進(jìn)而下調(diào)miR-155的表達(dá)。此外，紫草素是否對(duì)miR-155下游信號(hào)分子有作用、是否可促進(jìn)白血病細(xì)胞分化等尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

紫草素治療AML具有一定優(yōu)勢(shì)。AML患者處于免疫低下狀態(tài)，加之化療，使患者的免疫力再次受到打擊，細(xì)菌和真菌感染的發(fā)生率高，而紫草素具有一定的抗細(xì)菌和抗真菌感染能力[24]。關(guān)于藥物安全性問題，本課題組的前期研究[25]并未發(fā)現(xiàn)紫草素及其衍生物具有明顯的急性及慢性毒性反應(yīng)：急性毒性實(shí)驗(yàn)采用小鼠模型，最大給藥劑量為1 g·kg-1；慢性毒性實(shí)驗(yàn)采用大鼠模型，最高劑量為800 mg·kg-1灌胃，連續(xù)6個(gè)月。

綜上所述，紫草素可抑制FLT3-ITD突變?nèi)税籽V4-11細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，紫草素可下調(diào)AML不良預(yù)后分子miR-155的表達(dá)，進(jìn)而有可能逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)FLT3-ITD突變AML患者的不良預(yù)后。因此，紫草素可作為FLT3-ITD突變AML的潛在治療藥物之一。