沉默信息調節(jié)因子3對白藜蘆醇誘導的人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響

李松巖，林冬靜，于 洋，劉師兵，徐 路，孫 奇，徐 冶

(1. 吉林醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院腫瘤靶向治療與轉化醫(yī)學重點實驗室，吉林 吉林 132013；2. 吉林醫(yī)藥學院科研實驗室，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一[1-2]，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率占各類婦科惡性腫瘤的首位[3-5]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然的多酚類化合物，其抗腫瘤作用已經(jīng)得到確認[6-7]。沉默信息調節(jié)因子3 (silent mating type information regulation 3，Sirt3)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的Ⅲ類去乙?；?，其在線粒體的適應性反應中起調節(jié)作用[8]。研究[9-11]表明：Sirt3影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，當Sirt3基因缺失時，可以增加細胞的糖酵解過程，促進腫瘤的生長。Sirt3也可影響基因組，抑制癌癥相關代謝和影響腫瘤微環(huán)境，在癌癥的發(fā)展過程中發(fā)揮不同的作用[12-13]。研究[14-15]顯示：Res可以通過調節(jié)Sirt3表達進而調控細胞的功能。為了明確Res對SKOV3細胞的促凋亡作用，本研究采用Sirt3抑制劑3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶[3-(1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridine, 3-TYP]抑制Sirt3表達后，探討Sirt3在Res誘導SKOV3細胞凋亡中的作用機制，為進一步研究Res的抗腫瘤作用及其在臨床中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人卵巢癌SKOV3細胞由吉林醫(yī)藥學院腫瘤靶向治療與轉化醫(yī)學重點實驗室保存，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。Res購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，溶于DMSO中，4℃保存。MTT和DMSO購自Sigma公司，Hoechst 33342熒光染料購自北京鼎國公司，活性氧(ROS)熒光探針-DHE購自北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗人B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)和β-actin單克隆抗體及含有辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗均購自長春德爾塔生物有限公司，3-TYP購自上海陶術生物科技有限公司。恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)，超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾公司)，高速臺式冷凍離心機(德國Hermle公司)，倒置光學顯微鏡(日本Leica公司)，水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，Model-680型酶標儀、蛋白電泳儀和蛋白轉印儀(美國Bio-rad公司)，脫色搖床(北京六一醫(yī)學儀器廠)，超聲細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)，高溫高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司)，數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 MTT法檢測SKOV3細胞存活率 取對數(shù)生長期的SKOV3細胞以每孔5×104個細胞接種到96孔板中。Res用DMSO溶解后，用不同濃度(0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)Res處理細胞，培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT(5 mg·L-1)20 μL，4 h后棄去含有MTT的培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL。用酶標儀在490 nm處 檢測每孔吸光度(A)值。每次檢測重復3次。細胞存活率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.3 MTT法檢測各組細胞的增殖抑制率 取對數(shù)生長期的SKOV3細胞以每孔5×104個細胞接種到96孔板中。3-TYP用DMSO溶解后，稀釋成相應濃度。將細胞分為對照組、3-TYP(50 μmol·L-1)組、Res(30 mg·L-1)組和3-TYP+Res組，孵育24 h后，每孔加入MTT20 μL，4 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL。用酶標儀檢測每孔A值，每次檢測重復3次。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/空白組A值)×100%。

1.4 Hoechst 33342染色觀察SKOV3細胞核形態(tài) SKOV3細胞以1×105mL-1密度接種于24孔板，分組同上，24 h后用PBS洗滌3次，每孔加入4%多聚甲醛200 μL固定25 min，用PBS洗滌3次，加入200 μL Hoechst 33342熒光染料染色5 min，PBS洗滌3次，用甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察SKOV3細胞核形態(tài)。

1.5 ROS探針檢測SKOV3細胞中ROS水平 細胞分組同上，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入PBS 500 mL洗滌3次，加入用RPIM 1640培養(yǎng)液稀釋的ROS探針(1∶2 500)孵育20 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察探針顯色情況。以紅色熒光強度表示ROS水平。

1.6 Western blotting法檢測SKOV3細胞中相關蛋白表達水平 細胞分組同上，培養(yǎng)24 h, 收集各組細胞，用PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液RIPA 150 μL，用超聲細胞破碎儀破碎細胞后，冰上放置30 min，臺式高速冷凍離心機離心，收集上清。BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，PBST洗滌3次，用Sirt3抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶2 000)、Bax抗體(1∶2 000)、cleave caspase-3抗體(1∶500)和β-actin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日PBST洗滌3次，用HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，PBST洗滌5次，ECL顯色液顯色。以β-actin作為內參照，采用Quantity One軟件對結果進行分析處理，并計算目的蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 MTT法檢測SKOV3細胞存活率 不同濃度Res處理SKOV3細胞24 h后，隨著Res濃度的增高，細胞存活率明顯降低，Res的半數(shù)抑制濃度(IC50)為42.73 mg·L-1。見圖1。

圖1 MTT法檢測SKOV3細胞存活率Fig.1 Survival rates of SKOV3 cells detected by MTT method

2.2 各組細胞增殖抑制率和Hoechst 33342染色結果 與對照組(0.00%±1.37%)比較，Res組和3-TYP+Res組細胞增殖抑制率(0.26%±0.06%和0.47%±0.09%)明顯升高(P<0.05)；與Res組比較，3-TYP+Res組細胞增殖抑制率進一步升高(P<0.05)。應用Hoechst 33342染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察SKOV3細胞核形態(tài)表現(xiàn)：3-TYP+Res組細胞核出現(xiàn)固縮、染色增強、核碎裂增多，其余各組只有個別細胞出現(xiàn)類似現(xiàn)象。見圖2(插頁三)。

A：Control group；B：3-TYP group；C：Res group；D：3-TYP+Res group.
圖2 各組SKOV3細胞核形態(tài)表現(xiàn)(Hoechst 33342,×400)
Fig.2 Morphology of SKOV3 cell nuclei in various groups (Hoechst 33342,×400)

2.3 各組細胞中ROS水平 以ROS熒光探針-DHE進行染色，紅色熒光強度代表ROS水平，激光共聚焦顯微鏡下觀察。與對照組比較，3-TYP組細胞紅色熒光無明顯變化，Res組和3-TYP+Res組細胞紅色熒光明顯減少。見圖3(插頁三)。

A-D:ROS；E-H:Bright field; A,E：Control group；B,F：3-TYP group；C,G：Res group；D,H：3-TYP+Res group.
圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察各組SKOV3細胞中熒光強度(×400)
Fig.3 Fluorescence intensities in SKOV3 cells in various groups detected by laser confocal microscope(×400)

2.4 Western blotting法檢測各組細胞中凋亡相關蛋白表達水平 與對照組比較，3-TYP組細胞中Sirt3蛋白表達水平明顯降低(t=-5.37，P<0.05)，Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)；Res組細胞中Sirt3和Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(t=-8.71，P<0.05；t=-4.67，P<0.05)，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯升高(t=3.64，P<0.05；t=5.72，P<0.05)；與Res組比較，3-TYP+Res組細胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯升高(t=8.47，P<0.05；t=4.29，P<0.05)，Bcl-2和Sirt3蛋白表達水平明顯降低(t=-10.52，P<0.05；t=-7.61，P<0.05)。見圖4和表1。

Lane 1：Control group；Lane 2：3-TYP group；Lane 3：Res group；Lane 4：3-TYP+Res group.
圖4 Western blotting法檢測各組SKOV3細胞中凋亡相關蛋白表達電泳圖
Fig.4 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in SKOV3 cells in various groups detected by Western blotting method

表1 各組SKOV3細胞中Sirt3、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of Sirt3，Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in SKOV3 cells in various groups

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with Res group.

3 討 論

細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，其對一些婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展均可產(chǎn)生影響[16]。誘導腫瘤細胞凋亡是最理想的治療腫瘤的策略[17]。已有研究[18-19]證明：Res能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡，包括白血病、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和食道癌等。本研究結果表明：Res作用SKOV3細胞后，細胞存活率下降，且呈濃度依賴性，與已報道結果一致[9]。為進一步研究Res誘導SKOV3細胞凋亡的機制，本文作者用Sirt3抑制劑3-TYP作用于SKOV3細胞，進一步觀察Res對SKOV3細胞影響的結果顯示：與Res組比較， 3-TYP+Res組SKOV3細胞生長抑制率明顯升高，并且Hoechst 33342染色顯示細胞核染色增強、核碎裂明顯增多，表明應用3-TYP抑制Sirt3表達后，可增強Res對SKOV3細胞的抑制作用。研究[20]表明：線粒體中的Sirt3可以激活超氧化物歧化酶含錳金屬輔基(MnSOD)和異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)，防止ROS在線粒體中積累。而Res又具有明顯的抗氧化、抗自由基和抗癌等功效[21]，因此Sirt3可能通過ROS影響Res對SKOV3的作用。本研究結果顯示：與對照組比較，Res組SKOV3細胞中ROS水平降低，而3-TYP+Res組SKOV3細胞中ROS水平進一步降低，表明Sirt3通過細胞中ROS影響Res對SKOV3細胞的抑制作用。細胞凋亡的線粒體途徑中，Bcl-2家族起關鍵作用[20,22]。本研究結果顯示：與Res組比較，3-TYP和Res聯(lián)合作用SKOV3細胞24 h后，凋亡相關蛋白Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2和 Sirt3蛋白表達水平明顯降低，可能是抑制Sirt3后導致線粒體內ROS改變，進而使Res抗氧化能力的增強，SKOV3細胞內凋亡途徑被激活。

綜上所述，Res誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡的作用的機制可能是通過內源性線粒體途徑激活Bcl-2家族，進而激活caspase-3誘導細胞凋亡。Res可能通過Sirt3-ROS-Bcl-2通路誘導SKOV3細胞凋亡。Sirt3能夠協(xié)同Res增強細胞凋亡作用，但其最終能否成為治療腫瘤的一個新的途徑還需進一步研究。