NRP1基因敲除對放射性肺纖維化進(jìn)程的影響及其作用機(jī)制

董 卓， 李嘉樂， 陳肖逸， 王 蕊， 衣峻萱， 魏新鋒， 金順子

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021)

放射性肺纖維化(radiation-induced pulmonary fibrosis, RIPF)作為胸部腫瘤放療常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，對9%～30%接受胸部腫瘤放療的癌癥患者的預(yù)后和生活造成嚴(yán)重影響，其主要特征是肺泡上皮細(xì)胞損傷及成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞的聚積，以及膠原和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的沉積[1]。其中，參與形成RIPF病灶的成纖維細(xì)胞有多種來源，其主要來源之一是發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT-Ⅱ)，并且預(yù)防EMT被認(rèn)為是抑制組織纖維化的有效手段[2-4]。有研究[5-6]表明：Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smads通路與EMT的發(fā)生發(fā)展及ECM沉積有關(guān)。神經(jīng)菌毛蛋白1(neuropilin-1，NRP1)是最初在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的一種多功能的跨膜糖蛋白，其在生理或病理?xiàng)l件下均可作為TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和信號素3A(semakin 3A，Sema 3A)等多種生長因子或其配體的共受體，進(jìn)而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。在神經(jīng)、腫瘤和免疫等系統(tǒng)中發(fā)揮多種生物學(xué)功能[6-10]。目前，NRP1已被證明在增強(qiáng)TGF-β1信號傳導(dǎo)和促進(jìn)成纖維細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中起重要作用[11]，但其在RIPF中的作用尚未見報道。本研究采用野生型C57BL/6J小鼠和AT-Ⅱ細(xì)胞中特異性敲除NRP1基因小鼠建立RIPF小鼠模型，探討NRP1對RIPF進(jìn)程的影響及其在Wnt/β-catenin和TGF-β1/Smads通路所介導(dǎo)的EMT過程及ECM沉積中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器 攜帶FloxP位點(diǎn)的純合子C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠(NRP-1flox/flox)和肺組織中ATⅡ細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠(美國Jackson 實(shí)驗(yàn)室)。他莫昔芬(美國Sigma公司)，蘇木素和伊紅(中國索萊寶公司)，Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒和免疫組織化學(xué)試劑盒(中國福建邁新公司)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(中國大連寶生物工程公司)，鼠抗GAPDH抗體和兔抗NRP1抗體(美國Abcam公司)，兔抗TGF-β1抗體、兔抗Smad2抗體、兔抗α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體和兔抗Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ, ColⅠ)抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(美國Bioworld公司)，兔抗β-catenin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。X-RAD320生物輻照儀(美國PXI公司)，自動酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀和EX180TM酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，正置熒光顯微鏡和Olympus AX-70真彩圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Red公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和RIPF模型建立 通過將攜帶FloxP位點(diǎn)的純合子C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠(NRP1flox/flox)與AT-Ⅱ細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過幾輪交配，最后經(jīng)鑒定得到基因型為NRP1flox/flox-Cre+的C57BL/6J小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對符合基因型的160只C57BL/6J小鼠進(jìn)行編號排列，并按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)照射后不同時間點(diǎn)分為4周組、8周組、16周組和24周組，每組按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠又分野生型(Con)組、野生型單純照射(IR)組、NRP1基因特異性敲除(KO-Con)組和NRP1基因特異性敲除+照射(KO+IR)組，每亞組10只小鼠。

KO-Con和KO+IR組小鼠腹腔注射他莫昔芬(75 mg·kg-1)，每 24 h注射 1 次，連續(xù) 5 d，特異性敲除AT-Ⅱ細(xì)胞NRP1基因。利用X-RAD 320生物照射儀對 IR組和KO+IR組小鼠進(jìn)行全胸廓照射(其他部位用鉛板遮擋)，電壓為180 kV,電流為12.0 mA，靶皮距為70 cm，劑量率為2.0 Gy·min-1，單次照射劑量為20 Gy。并于照射后4、8、16和24周處死各組小鼠，取肺組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 小鼠肺組織HE染色和Masson 染色 所提取小鼠肺組織用4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋、4 μm厚切片。對切片進(jìn)行HE染色和Masson染色，在100倍光鏡下觀察肺組織形態(tài)表現(xiàn)和膠原蛋白沉積情況。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測小鼠肺組織中Col Ⅰ和 α-SMA 蛋白表達(dá) 將小鼠肺組織用4%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片。之后進(jìn)行脫蠟、水化及抗原修復(fù)，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作，對肺組織中 Col Ⅰ 和α-SMA蛋白進(jìn)行染色。最后，光學(xué)顯微鏡下觀察到棕黃色或棕褐色顆粒者為 Col Ⅰ和α-SMA 蛋白的陽性表達(dá)。

1.5 Western blotting法檢測小鼠肺組織中NRP1、TGF-β、Smad 2和β-catenin 蛋白表達(dá)水平 小鼠肺組織加入遇冷的蛋白裂解液，電動勻漿至完全裂解，離心收集上清液，BCA蛋白定量，加入蛋白上樣緩沖液并煮沸 5 min。蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，ECL 顯色液顯色，暗室曝光。在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，檢測各條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參照。目的蛋白相對表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.6 qRT-PCR法檢測小鼠肺組織中NRP1、Col Ⅰ、α-SMA、β-catenin、TGF-β1、Smad2、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA表達(dá)水平 在 PubMed 的 GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索出NRP1和肺纖維化相關(guān)標(biāo)志物的基因序列，委托上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成熒光定量 PCR 引物，引物序列見表1。用RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用qRT-PCR試劑盒于PCR擴(kuò)增儀中檢測基因相對表達(dá)水平。 PCR 反應(yīng)條件： 95℃、5 min；95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR primers

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織HE染色和Masson染色結(jié)果 照射后8周內(nèi)，與Con組比較，KO-Con組小鼠肺組織無明顯變化；IR組小鼠肺組織主要表現(xiàn)為放射性肺炎，炎細(xì)胞增多，肺紋理增粗，肺間隔增寬；KO+IR組小鼠肺組織可見少許的肺泡壁增厚和肺泡腔的融合擴(kuò)大，炎癥反應(yīng)較IR組弱。至照射后第24周，與Con組比較，KO-Con組小鼠肺組織無明顯變化；IR組小鼠肺組織可見小片纖維化逐漸發(fā)展成為典型的纖維化病灶，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔增厚，肺泡結(jié)構(gòu)消失；KO+IR組小鼠肺組織僅見部分肺泡萎陷，局部間隔增寬，病理形態(tài)表現(xiàn)較IR組輕。IR組和KO+IR組小鼠肺組織RIPF病理形態(tài)表現(xiàn)隨照射后時間延長而逐漸加重，且KO+IR組小鼠RIPF病理形態(tài)表現(xiàn)在照射后各時間點(diǎn)均較 IR組輕。見圖1(插頁一)和圖2(插頁二)。

A-D:4 weeks;E-H:8 weeks;I-L:16 weeks;M-P:24 weeks;A,E,I,M:Con group;B,F,J,N:KO-Con group;C,G,K,O:IR group;D,H,L,P:KO+IR group.
圖1 HE染色觀察照射后不同時間各組小鼠肺組織形態(tài)表現(xiàn)(×100)
Fig.1 Morphology of lung tissue of mice at different time after irradiation in various groups observed by HE staining (×100)

A-D:4 weeks;E-H:8 weeks;I-L:16 weeks;M-P:24 weeks;A,E,I,M:Con group;B,F,J,N:KO-Con group;C,G,K,O:IR group;D,H,L,P:KO+IR group.
圖2 Masson染色觀察各組小鼠肺組織膠原沉積情況(×100)
Fig.2 Collagen deposition in lung tissue of in mice in various grouops observed by Masson staining (×100)

2.2 各組小鼠肺組織中NRP1蛋白和mRNA表達(dá)水平 Western blotting法檢測結(jié)果：與 Con組比較，KO-Con組小鼠肺組織中NRP1蛋白表達(dá)水平均降低，IR組小鼠肺組織中NRP1蛋白表達(dá)水平隨時間延長逐漸升高，24周時達(dá)到最高；與 IR組比較，KO+IR組小鼠肺組織中NRP1蛋白表達(dá)水平隨時間延長逐漸降低(圖3)。qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示：與 Con組比較，KO-Con組小鼠肺組織中NRP1 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)，IR組小鼠肺組織中NRP1 mRNA表達(dá)水平隨時間延長逐漸升高(P<0.05或P<0.01)，24周時達(dá)到最高(P<0.01)；與 IR組比較，KO+IR組小鼠肺組織中NRP1 mRNA表達(dá)水平隨時間延長逐漸降低，16和24周時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

Lane 1:Con group;Lane 2:KO-Con group;Lane 3:IR group;Lane 4:KO+IR group.
圖3 各組小鼠肺組織中 NRP1蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.3 Electrophoregram of expressions of NRP1 protein in lung tissue of mice in various groups

2.3 各組小鼠肺組織中Col Ⅰ和α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：與Con組比較，KO-Con組小鼠肺組織中Col Ⅰ 和α-SMA蛋白陽性表達(dá)量降低，IR組和KO+IR組小鼠肺組織中Col Ⅰ 和α-SMA蛋白陽性表達(dá)量逐漸升高，各時間點(diǎn)IR組均明顯高于Con組。與IR組比較，KO+IR組小鼠肺組織中Col Ⅰ 和α-SMA蛋白陽性表達(dá)量在各時間點(diǎn)均明顯降低(圖4和5，見插頁二)。qRT-PCR法檢測結(jié)果：與Con組比較，KO-Con組小鼠肺組織中Col Ⅰ 和α-SMA mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IR組小鼠肺組織中Col Ⅰ 和α-SMA mRNA表達(dá)水平隨時間的延長逐漸升高(P<0.05或P<0.01)。與IR組比較，KO+IR組小鼠肺組織中Col Ⅰ 和α-SMA mRNA表達(dá)水平隨時間延長逐漸降低，在16和24周時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

A-D:4 weeks;E-H:8 weeks;I-L:16 weeks;M-P:24 weeks;A,E,I,M:Con group;B,F,J,N:KO-Con group;C,G,K,O:IR group;D,H,L,P:KO+IR group.
圖4 各組小鼠肺組織中Col Ⅰ蛋白表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)，×400)
Fig.4 Expressions of Col Ⅰ protein in lung tissue of mice in various groups (Immunohistochemistry,×400)

A-D:4 weeks;E-H:8 weeks;I-L:16 weeks;M-P:24 weeks;A,E,I,M:Con group;B,F,J,N:KO-Con group;C,G,K,O:IR group;D,H,L,P:KO+IR group.
圖5 各組小鼠肺組織中α-SMA蛋白表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)，×400)
Fig.5 Expressions of α-SMA protein in lung tissue of mice in various groups (Immunohistochemistry,×400)

表2 各組小鼠肺組織中 NRP1 mRNA 表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of NRP1 mRNA in lung tissue of mice in various groups

*P<0.05，**P<0.01vsCon group；△P<0.05，△△P<0.01vsIR group.

表3 各組小鼠肺組織中Col Ⅰ和α-SMA mRNA 表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of α-SMA and ColⅠmRNA in lung tissue of mice in various groups

*P<0.05，**P<0.01vsCon group；△P<0.05，△△P<0.01vsIR group.

2.4 各組小鼠肺組織中β-catenin、TGF-β1和Smad2蛋白和mRNA表達(dá)水平 Western blotting法檢測結(jié)果：隨時間的延長，KO-Con組小鼠肺組織中β-catenin、TGF-β1和Smad2 蛋白表達(dá)水平逐漸降低，各時間點(diǎn)均低于Con組； 隨時間的延長，IR組和KO+IR組小鼠肺組織中β-catenin、TGF-β1和Smad2 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，且各時間點(diǎn)均高于Con組；KO+IR組小鼠肺組織中β-catenin、TGF-β1和Smad2蛋白在各時間點(diǎn)均明顯低于IR組，但仍高于Con組(圖6)。 qRT-PCR法檢測結(jié)果：與Con組比較，各時間點(diǎn)KO-Con組小鼠肺組織中β-catenin、TGF-β1和Smad2 mRNA表達(dá)水平均不同程度降低(P<0.05)，IR組小鼠肺組織中β-catenin、TGF-β1和Smad2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與IR組比較，16和24周時KO+IR組小鼠肺組織中β-catenin和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平及8、16和24周時Smad2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表4。

2.5 各組小鼠肺組織中E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)水平 與Con組比較，各時間點(diǎn)KO-Con組小鼠肺組織中E-Cadherin mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，N-Cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IR組小鼠肺組織中E-Cadherin mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，N-Cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與IR組比較，16和24周時KO+IR組小鼠肺組織中E-Cadherin mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，24周時N-Cadherin mRNA表達(dá)水平、16和24周時Vimentin mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表5。

Lane 1:Con group;Lane 2:KO-Con group;Lane 3:IR group;Lane 4:KO+IR group.圖6 各組小鼠肺組織中β-catenin、TGF-β1和Smad2 mRNA表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of β-catenin，TGF-β1，and Smad2 mRNA in lung tissue of mice in various groups

表4 各組小鼠肺組織中 β-catenin、TGF-β1和Smad2 mRNA 表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of β-catenin,TGF-β1 and Smad2 in lung tissue of mice in various groups

*P<0.05，**P<0.01vsCon group；△P<0.05，△△P<0.01vsIR group.

3 討 論

放射治療是目前腫瘤治療三大手段之一，約70%的惡性腫瘤患者在其治療過程中均會接受放射治療。然而，在臨床常見的胸部腫瘤放射治療過程中，肺臟作為輻射中度敏感器官，腫瘤周圍的正常肺組織因所受放療劑量超過其生物效應(yīng)的閾值而產(chǎn)生不同程度的損傷[12]。放射性肺損傷在前期表現(xiàn)為放射性肺炎，在后期(>6個月)表現(xiàn)為肺纖維化。本研究通過對野生型和AT-Ⅱ細(xì)胞特異性敲除NRP1基因的C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行全胸局部單次X射線照射(20 Gy，2.0 Gy·min-1)成功建立RIPF小鼠模型, HE染色和Masson染色結(jié)果表明：NRP1基因的特異性敲除在小鼠RIPF發(fā)生過程中起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用，可減少膠原的沉積，減輕肺纖維化程度。

表5 各組小鼠肺組織中 E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)水平Tab.5 Expression levels E-Cadherin,N-Cadherin and Vimentin mRNA in lung tissue of mice in various groups

*P<0.05，**P<0.01vsCon group；△P<0.05，△△P<0.01vsIR group.

有研究[13-14]顯示：肺部受損傷后，成纖維細(xì)胞可激活分化為沉積纖連蛋白和膠原基質(zhì)能力更強(qiáng)的肌成纖維細(xì)胞，分泌產(chǎn)生含有α-SMA、纖連蛋白和Col Ⅰ 的ECM。在正常的肺組織修復(fù)中，肌成纖維細(xì)胞可以通過凋亡而消除，但在 RIPF患者中肌成纖維細(xì)胞卻持續(xù)存在而免于凋亡[15]。因此，肌成纖維細(xì)胞是RIPF病灶的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，引起過多的ECM沉積，導(dǎo)致RIPF。本研究從mRNA和蛋白層面對小鼠肺部ECM沉積情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：NRP1基因的特異性敲除可明顯抑制小鼠肺組織中α-SMA和Col Ⅰ 的表達(dá)。α-SMA表達(dá)降低說明成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的能力減弱，NRP1基因的特異性敲除可能通過在RIPF過程中抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，從而抑制ECM沉積。

Wnt/β-catenin 信號通路是一條在進(jìn)化中高度保守的信號通路，在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞維持、傷口愈合和其他生理過程中起至關(guān)重要的調(diào)控作用[16]。Wnt/β-catenin 信號通路中Wnt配體包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10和Wnt10b，其中Wnt3a是Wnt經(jīng)典途徑的代表蛋白[17]。Wnt活化并激活肺上皮細(xì)胞中的β-catenin，這是肺纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可促進(jìn)EMT，誘發(fā)成纖維細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞的分化，加速ECM沉積，而抑制Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)可減弱甚至逆轉(zhuǎn)肺纖維化和腎纖維化[5, 17]。有研究[5，18]表明：Wnt/β-catenin 信號通路在RIPF的發(fā)生發(fā)展過程中起調(diào)控作用，其與TGF-β 信號通路之間存在交叉串?dāng)_，Wnt/β-catenin 以TGF-β依賴的方式, 通過Smad3蛋白C-末端和β-catenin蛋白N-末端區(qū)域相互作用, 影響β-catenin，2個信號通路相互作用形成的胞內(nèi)蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)啟動系列基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示：NRP1基因的特異性敲除可能通過下調(diào)β-catenin的方式參與Wnt/β-catenin 信號通路在RIPF病灶抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化和ECM過度沉積的調(diào)節(jié)，減輕RIPF的病理形態(tài)表現(xiàn)。

TGF-β1/ Smads通路的失調(diào)是組織纖維化的重要致病機(jī)制。TGF-β1作為重要的促纖維化生長因子，其在RIPF進(jìn)程中主要起到促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化和ECM合成及沉積等作用[19]。有研究[20]表明：NRP1可能在細(xì)胞膜捕獲TGF-β1和LAP-TGF-β1過程中發(fā)揮重要作用，從而增強(qiáng)TGF-β1信號傳導(dǎo)，促進(jìn)TGF-β1分泌，進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展?；|(zhì)成纖維細(xì)胞中NRP1的下調(diào)減少了TGF-β1誘導(dǎo)的Smad 2/3磷酸化，從而降低了α-SMA的表達(dá)。本研究結(jié)果表明：NRP1基因的特異性敲除可能通過下調(diào)TGF-β1和Smad2的方式參與TGF-β1/Smads通路對RIPF的調(diào)節(jié)，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化并抑制ECM的過度沉積，進(jìn)而抑制RIPF進(jìn)程。

RIPF 的病灶主要由成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和沉積的 ECM 構(gòu)成。其中，肌成纖維細(xì)胞的可能來源包括駐留的基質(zhì)成纖維細(xì)胞、骨髓來源的纖維細(xì)胞和一部分經(jīng)歷EMT的AT-Ⅱ細(xì)胞[21]。發(fā)生EMT 的AT-Ⅱ細(xì)胞是肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中成纖維細(xì)胞的重要來源[22]。AT-Ⅱ細(xì)胞在生理?xiàng)l件下合成和分泌大量蛋白質(zhì)以產(chǎn)生肺表面活性物質(zhì)并維持氣道免疫防御[23]。同時，作為肺泡干細(xì)胞，AT-Ⅱ細(xì)胞通過分化成肺泡Ⅰ型細(xì)胞(alveolar type I epithelial cell，AT-Ⅰ)使肺泡上皮再生[24]。在肺組織受到損傷后，AT-Ⅱ細(xì)胞識別和清除錯誤折疊蛋白的能力降低，錯誤折疊蛋白在患者肺部大量積累，導(dǎo)致AT-Ⅱ細(xì)胞功能衰退[23]。EMT是一種動態(tài)的、可逆的過程，涉及胚胎發(fā)育、傷口愈合、癌癥轉(zhuǎn)移和纖維化等環(huán)節(jié)，并且與細(xì)胞遷移和侵入能力的增強(qiáng)有關(guān)[22, 25]。發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞失去接觸黏附能力和頂端-基底極性，形態(tài)發(fā)生改變。同時，其細(xì)胞骨架發(fā)生明顯變化，獲得遷移和ECM侵襲的能力并出現(xiàn)一些間充質(zhì)特征[26-27]。也有研究[13]表明：發(fā)生EMT的細(xì)胞可能通過增強(qiáng)細(xì)胞硬度和提供促纖維化細(xì)胞因子的方式，間接刺激肌成纖維細(xì)胞群，誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生，而不會分泌過多的膠原蛋白。本研究結(jié)果顯示：NRP1基因的特異性敲除明顯下調(diào)了N-cadherin與Vimentin的表達(dá)，上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)，表明NRP1基因的敲除可抑制RIPF過程中AT-Ⅱ細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的分化，進(jìn)而抑制RIPF進(jìn)程。

綜上所述，NRP1可在RIPF進(jìn)程中起到促進(jìn)小鼠肺組織上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，并同時促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化造成ECM過度沉積的作用，NRP1可能通過上調(diào)β-catenin的方式激活Wnt信號通路，通過上調(diào)TGF-β1和Smad2的方式激活TGF-β1/Smads通路，促進(jìn)RIPF發(fā)展。NRP1基因的敲除可抑制RIPF的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)小鼠肺組織中Wnt/β-catenin和TGF-β1/Smads信號通路的表達(dá)進(jìn)而抑制EMT 進(jìn)程有關(guān)。

本研究初步闡明了RIPF發(fā)病的分子機(jī)制，對下一步有針對性地研究靶向藥物、提高胸部腫瘤放療療效具有重要意義。