家禽胚蛋注射技術(shù)的應(yīng)用研究(綜述)1

賈良梁

摘? 要：雛雞出殼時要面對多種應(yīng)激因素，此時機(jī)體的免疫狀況對它的存活和抗病能力有重要的影響。眾多研究表明，胚蛋注射（又稱“卵內(nèi)注射”）疫苗可以高效率、低成本和有效地誘導(dǎo)入孵種蛋的胚胎產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而增強(qiáng)雛雞出殼后抗感染的能力。本文將介紹當(dāng)前胚蛋注射不同疫苗的應(yīng)用和研究情況。

關(guān)鍵詞：胚蛋注射;疫苗;家禽

中圖分類號：S815 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號：1001-0769（2020）01-0003-04

1? 馬立克氏病

Sharma和Burmester通過一項基本的實驗室試驗率先向認(rèn)為胚蛋注射疫苗可以用于保護(hù)家禽免遭馬立克氏?。∕arek's Disease，MD）的侵害。此后胚蛋免疫也被用于預(yù)防家禽的傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBDV）、新城疫（Newcastle Disease，ND）和禽流感（Avian Influenza，AI），并且已經(jīng)在全球發(fā)展成標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)慣例。Sharma和Burmester報道，在孵化的第18天給入孵種蛋的胚胎接種可免疫火雞皰疹病毒（Herpesvirus of Turkey，HVT） FC126毒株的疫苗，出殼后3 d再向雛雞腹腔注射致病性MD病毒，由此產(chǎn)生的抵抗力比在出雛后1 d經(jīng)頸后皮下接種疫苗的雛雞要強(qiáng)許多。用長2.54 cm的配置22-G針頭的注射器給入孵種蛋的胚胎接種0.1 mL HVT，整根針頭需通過入孵種蛋的大頭或長軸中間的小孔插入。當(dāng)從入孵種蛋側(cè)邊注射時，接種物分別以55%、25%和20%的比例注射到胚體、羊水和卵黃囊中;當(dāng)從入孵種蛋的大頭注射時，接種物分別以11%、89%和0的比例注射到胚體、羊水和卵黃囊中。雖然胚蛋注射不會影響入孵種蛋的孵化率，但能夠使雛雞從出雛到8周齡一直處于病毒血癥狀態(tài)。此外，與出殼后接種的雛雞相比，孵化期接種的雛雞具有更高的可復(fù)活病毒滴度。因此，我們認(rèn)為出殼前的接種不僅可以保護(hù)雛雞避免隨后發(fā)生自然感染傳染性病毒病，而且疫苗毒株最少只需要6 d就能給雛雞提供最大的保護(hù)力。

Sharma等開展了類似的后續(xù)研究，結(jié)果證實在入孵種蛋孵化第18天給胚胎接種Ⅰ型和Ⅱ型MD毒株以及HVT可以明顯提高雛雞的免疫力。具體來說，胚蛋接種而不是出雛時接種能對在3日齡時用MD強(qiáng)毒株攻毒的雛雞提供更好的保護(hù);在孵化第18天給胚胎接種HVT能使病毒在胚胎組織中快速增殖，尤其是能提高病毒在肺部的增殖速度。Wakenell等在2002年開展了一項新研究，即采用人工方法，用配置18-G針頭的注射器給胚蛋接種HVT/SB-1疫苗，結(jié)果表明，要想使雛雞獲得最佳的生產(chǎn)性能，用胚蛋注射法接種MD疫苗時，疫苗必須注入無特定病原體（Specific-Pathogen-Free，SPF）雞或肉用雞入孵種蛋胚胎的羊膜或胚體的適當(dāng)部位。

在最近的多項研究中，Peebles等證明，在孵化第18天向胚胎的羊膜或胚體自動化注射50 μL MD疫苗，無論雛雞在入舍前是否經(jīng)歷了4 h或8 h的等待時間，羅斯708肉雞出殼后的早期質(zhì)量均未受到影響。Peebles等還證明，相同的疫苗接種法不會加劇4 h～18 h的入舍等待時間對雛雞出殼后48 d內(nèi)的生長性能的影響。

2? 傳染性法氏囊病

Giambrone等最早研究胚蛋注射法接種3種半成品IBD疫苗對日常保護(hù)雞免遭IBDV標(biāo)準(zhǔn)抗原變異株攻毒的安全性和效力。該疫苗用長2.54 cm的配置21-G針頭的注射器從入孵種蛋的氣室人工注入孵化第18天的SPF雞或肉用雞入孵種蛋胚胎。雛雞在3周齡通過滴鼻或點眼途徑接受平均劑量為103 PFU的IBDV強(qiáng)毒株的攻毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然所有疫苗均會使1～3周齡雛雞的法氏囊出現(xiàn)嚴(yán)重的顯微病變，但是它們對IBDV標(biāo)準(zhǔn)毒株的最低保護(hù)率達(dá)到87%，對IBDV強(qiáng)毒株的最低保護(hù)率為60%。三種疫苗中的任何一種以充足劑量進(jìn)行胚蛋接種均會提高胚胎和3周齡雛雞的死亡率，而接種半劑量的疫苗對上述兩種死亡率均無不利影響。因此，在進(jìn)行胚蛋接種時，稀釋使用IBD和MD半劑量商用疫苗能避免雛雞發(fā)生免疫抑制反應(yīng)和死亡。

此外，在隨后同樣使用SPF雞和肉雛雞進(jìn)行的一項研究中，Moura等測試了重組減毒疫苗對IBDV攻毒后的家禽的保護(hù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在孵化第18天給胚胎接種2.3×103 PFU或5.6×103 PFU的疫苗，可以對2種雛雞產(chǎn)生保護(hù)作用，使它們在2周齡時被IBDV STC毒株攻毒后免于死亡，同時法氏囊免受損傷。此外，2種劑量能夠讓SPF雞和肉雛雞產(chǎn)生高水平的抗體，且不會影響入孵種蛋的孵化率和雛雞出雛后第1周的存活率。然而，接種更低劑量的疫苗會對SPF雛雞產(chǎn)生充分的保護(hù)作用，要想使肉雛雞產(chǎn)生充分的免疫力則需要接種更高劑量的疫苗。雖然注射的途徑和胚蛋的目標(biāo)組織區(qū)域并未被確定，但是，我們可以假設(shè)疫苗是通過入孵種蛋的大頭人工注射入羊膜內(nèi)的。

3? 新城疫

Stone等在孵化第18天利用胚蛋注射法給白洛克雞和白來杭雞的入孵種蛋接種劑量和抗原濃度各不相同的新城疫油乳劑滅活苗，以此評估疫苗劑量和抗原濃度對種蛋孵化率和雛雞免疫力的影響。試驗使用配置16-G針頭或22-G針頭的注射器，疫苗被注入入孵種蛋小頭下深3.81 cm處，以便使疫苗能夠沉積在胚胎皮下的卵黃中或體腔內(nèi)。在雛雞出殼2周時首次測定血清血凝抑制效價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雛雞的血清轉(zhuǎn)化率介于27%～100%，胚蛋接種能改善雛雞在53日齡時感染新城疫病毒嗜內(nèi)臟型強(qiáng)毒株后的發(fā)病率和死亡率。用配置18-G針頭、20-G針頭或22-G針頭的注射器注射100 μL疫苗對白洛克雞和白來杭雞的入孵種蛋孵化率無顯著影響。Stone等得出的結(jié)論是，如果新城疫疫苗含有充足水平的抗原并接種得當(dāng)，那么胚蛋接種可產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫力以及令人滿意的血清轉(zhuǎn)化率和孵化率。

4? 禽流感

Stone等還評估了白洛克雞和白來杭雞的入孵種蛋在孵化第18天接種禽流感油乳劑滅活苗后的孵化率和出殼雛雞免疫力受影響情況。Stone等采用與新城疫疫苗相同的接種流程。同樣，血清血凝抑制滴度首次測定時間是雛雞為2周齡時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雛雞血清轉(zhuǎn)化率介于85%～100%，胚蛋接種能改善雛雞在34日齡時用高致病性禽流感病毒攻毒后的發(fā)病率和死亡率。至于新城疫疫苗，Stone等發(fā)現(xiàn)，白洛克雞和白來杭雞的入孵種蛋胚胎用配置18-G針頭、20-G針頭或22-G針頭的注射器注射? ? 100 μL疫苗后，它們的孵化率均未受到顯著的影響。Stone等推斷，如果禽流感疫苗像新城疫疫苗一樣含有充足水平的禽流感病毒抗原并且接種得當(dāng)，那么胚蛋接種會使雛雞產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫力以及令人滿意的血清轉(zhuǎn)化率和孵化率。

5? 球蟲病

Sokale等利用商用多蛋注射機(jī)給孵化第18.5天的羅斯708肉雞的入孵種蛋接種50 μL含有堆形艾美球蟲（Eimeria acervulina）、巨型艾美尓球蟲（Eimeria maxima）和柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）卵囊的球蟲疫苗——Inovocox EM1疫苗（碩騰公司生產(chǎn)，美國密歇根州喀拉馬索市）。結(jié)果表明，入孵種蛋的孵化率和孵化第21.5天胚胎重（Body Weight，BW）均未受到顯著的影響。然而，當(dāng)接種劑量中84.8%和15.3%的疫苗分別被注入入孵種蛋的胚胎中或羊膜內(nèi)，雛雞在出殼后第4天開始排出體內(nèi)的球蟲卵（注射后第6天），并持續(xù)到第13天，排卵高峰出現(xiàn)在第7天（注射后第10天）。盡管注射Inovocox EM1疫苗肯定會使胚胎出現(xiàn)疫苗誘導(dǎo)型感染，但對肉用種雞的入孵種蛋胚胎發(fā)育或初生雛雞的質(zhì)量沒有不良影響。該研究結(jié)果表明，在孵化第18.0天至第18.8天之間給入孵種蛋的胚胎注射Inovocox EM1疫苗可以安全且有效地提前刺激雛雞的免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生免疫力以抵抗隨后的球蟲感染。

隨后，Sokale等開展了一項配套研究，探討Inovocox EM1疫苗對羅斯708肉雞的雛雞出殼后14 d生長性能的影響情況。試驗設(shè)計與早先研究所用的相同，但是本次試驗檢測了雛雞的死亡率、采食量、增重和飼料轉(zhuǎn)化率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋液組和疫苗組的雛雞在所有生長性能指標(biāo)上均無顯著差異。然而，稀釋液組雛雞和疫苗組雛雞在14日齡的BW、7～14日齡的采食量和增重以及0～14日齡采食量上均顯著高于未注射的對照組雛雞。因此，這些后續(xù)結(jié)果證實，在孵化第18.0天至第18.8天給羅斯708肉雞的入孵種蛋接種Inovocox EM1疫苗是安全的，因為它不僅不影響種蛋的胚胎發(fā)育和出殼雛雞的質(zhì)量，而且也不影響雛雞出殼后14 d的總體生長性能。

Sokale等在2018年進(jìn)一步測定了給入孵種蛋的胚胎注射Inovocox EM1疫苗對新生雛雞多項指標(biāo)以及對羅斯708肉雞35日齡生產(chǎn)性能的影響情況。按免疫劑量的1倍或10倍接種疫苗不會影響入孵種蛋的孵化率和雛雞出殼時的絕對體重，但是接種10倍劑量的疫苗會降低雛雞出殼體重占種蛋重的百分比，兩種劑量均會降低雛雞在21～28日齡以及0～35日齡時的增重，提高雛雞21～28日齡時的飼料轉(zhuǎn)化率（Feed Conversion Ratio，F(xiàn)CR），并提高雛雞28日齡時腸道的相對重量。該研究獲得的疫苗注射會對雛雞14日齡后的生長性能產(chǎn)生不良影響的結(jié)果與Sokale等在2017年得到的雛雞14日齡前的試驗結(jié)果相反，但其最新的結(jié)果再次驗證了先前的結(jié)果，并進(jìn)一步建議接種1倍免疫劑量的Inovocox EM1疫苗可能更安全，并且可充分確保球蟲卵完成生活史。

6? 雞敗血支原體

雞敗血支原體F株是商業(yè)性蛋雞行業(yè)用于預(yù)防蛋雞感染雞敗血支原體野毒株的一種疫苗株。Elliott等在入孵種蛋孵化第18天向胚胎的羊膜中注射50 μL雞敗血支原體F株疫苗。棉拭子檢測表明，后續(xù)孵出的雛雞氣管、口腔、食道、卵黃膜和十二指腸均感染了雞敗血支原體F株。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)和不同劑量對種蛋孵化率的影響，我們認(rèn)為給蛋雞的入孵種蛋胚胎接種低劑量（不高于120 CFU/劑）的雞敗血支原體F株在商業(yè)性食用蛋行業(yè)中有實際應(yīng)用價值。

7? 核苷酸疫苗

Dalloul等研究了利用胚蛋注射法給白來杭雞的入孵種蛋胚胎注入胞嘧啶鳥嘌呤（Cytosine-phosphate-Guanine，CpG）寡脫氧核糖核苷酸對雛雞的球蟲易感性的影響。研究人員利用商業(yè)化多蛋注射系統(tǒng)在入孵種蛋孵化第18天向胚胎的羊膜腔中注入疫苗（溶于100 μL滅菌磷酸緩沖鹽溶液中）。雖然胚蛋接種25 μg含有2種非甲基化CpG序列之一的寡脫氧核糖核苷酸不會顯著影響雛雞的增重，但是胚蛋注射能夠減少雛雞隨后排放的球蟲蟲卵數(shù)，這證明其能夠增強(qiáng)試驗雞抵抗堆形艾美耳球蟲感染的能力。此外，當(dāng)與? ? ?10 μg、33 μg或100 μg重組艾美耳球蟲微粒子蛋白聯(lián)合給藥時，其中一種CpG寡脫氧核糖核苷酸的劑量達(dá)到25 μg時能夠使雛雞在感染柔嫩艾美耳球蟲前產(chǎn)生最高的抗體應(yīng)答反應(yīng)，而且能夠顯著提高雛雞的增重，降低雛雞在感染堆型艾美耳球蟲后的蟲卵排泄量。這些研究人員得出的結(jié)論是，利用胚蛋注射法給藥，CpG寡脫氧核糖核苷酸能夠提高雛雞的免疫力，并在雛雞感染艾美耳球蟲后發(fā)揮輔助性免疫作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，無論是否與重組艾美耳球蟲蛋白聯(lián)用，用胚蛋注射法給入孵種蛋胚胎注射CpG寡脫氧核糖核苷酸在增加雛雞對某些艾美耳球蟲的抵抗力上具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價值。

原題名：In ovo applications in poultry： A review（英文）

原作者：E. D. Peebles （密西西比州立大學(xué)）