PCSK9 基因5′UTR區(qū)rs45448095基因多態(tài)性與血漿LDL-C水平的相關(guān)性*

張營， 吳晟， 鮑海龍， 劉興德

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽 550025)

研究表明，血漿低密度脂蛋白(LDL-C)的高水平表達不僅僅影響冠心病，還可以增加缺血性腦卒中的風(fēng)險[1-3]。全球人群中肥胖、高LDL-C以及相關(guān)疾病發(fā)病率、致死率越來越高[4-5]，降LDL-C治療成為一個值得重視的問題。2003年關(guān)于家族性高膽固醇血癥的大型全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的研究表明，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是影響血脂代謝的關(guān)鍵基因[6]，其抑制劑可作為降低LDL-C藥物被應(yīng)用于臨床。臨床試驗表明，不管單獨應(yīng)用、還是聯(lián)合應(yīng)用PCSK9抑制劑可降低45%～60%的LDL-C水平[7-8]。目前關(guān)于PCSK9基因非編碼區(qū)的基因多態(tài)性與血漿LDL-C水平、以及冠心病風(fēng)險的研究并不多，本研究對PCSK9基因5′UTR區(qū)基因多態(tài)性進行分析，探討基因多態(tài)性與血漿LDL-C水平及冠心病風(fēng)險的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 96名于2014年5月-2015年10月來自武漢同濟醫(yī)院心內(nèi)科住院冠心病患者為疾病組。冠心病診斷標準:(1)冠狀動脈造影評估至少一段冠狀動脈(右冠狀動脈、旋支或前降支)>50%狹窄，(2)有典型的心肌酶學(xué)升高(肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌酸激酶)、典型心電圖改變和臨床癥狀，(3)有冠狀動脈搭橋術(shù)或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的病史；排除有先天性心臟病、心肌病、瓣膜病和腎臟或肝臟疾病，嚴重腫瘤病史的患者。選取同期96例空腹血脂(總膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)正常的體檢者為對照組, 入選人群未使用降脂藥物、重大疾病或病態(tài)肥胖(體質(zhì)量指數(shù)>30 kg/m2)；疾病組患者和對照組均為漢族血統(tǒng)，并提供書面知情同意書，本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 HEK293T細胞系、L02細胞由華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院高血壓研究所饋贈，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、dNTP、5×PrimeSTAR GXL緩沖液購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(takara中國)，引物由武漢天一輝遠公司合成，DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，pGL3-basic熒光報告基因載體購自武漢啟動子生物有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自invitrogen公司，雙熒光素酶報告檢測試劑購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1標本采集及DNA提取 抽取疾病組及健康對照組人群外周靜脈血2 mL，采用天根DNA提取試劑盒提取外周血白細胞DNA，放入-20°冰箱保存。

1.2.2信息學(xué)分析 使用千人基因組數(shù)據(jù)庫(http://grch37.ensembl.org)分析中國漢族人群(han chinese in beijing, southern han chinese,共計208人)PCSK9 基因5′UTR區(qū)基因多態(tài)性。

1.2.3熒光報告基因?qū)嶒?采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從人DNA中擴增包含野生型等位基因(rs45448095-C)的362 bpPCSK9序列，其中Mlu1或HindIII限制性內(nèi)切酶切位點分別位于5′和3′端，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后插入pGL3熒光素酶報告載體。利用攜帶突變等位基因的引物進行PCR重疊，得到包含rs45448095-T序列的突變載體(引物F為 GTCCGATGGGGCTCTGGTG, 引物R為GAGGGCCAGGGGAGAGGTT)。HEK293T細胞和L02細胞接種在24孔板中，帶細胞密度至1×106細胞/孔時，將PGL3-T(rs45448095-T)或PGL3-C(rs45448095-C)400 ng與Renilla熒光素酶質(zhì)粒50 ng共轉(zhuǎn)染，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗細胞，用被動裂解緩沖液裂解細胞(Promega, WI, USA)，反復(fù)凍融3遍保證細胞充分裂解。使用熒光素酶活性發(fā)光計(SIRIUS, Pforzheim, Germany)測量熒光素酶的表達水平。每組選取6個副孔，重復(fù)3次獨立實驗。

1.2.4rs45448095位點檢測 從人血DNA中擴增362 bp片段,采用Sanger法完成位點測序，方法參考文獻[9]。Applied Biosystems 3130XL毛細管測序儀(applied biosystems,foster city,CA)分析PCR片段中熒光染料終結(jié)者循環(huán)產(chǎn)物；通過Chromas程序(technelysium Pty)鑒定了假定的多態(tài)性。結(jié)果由2名獨立觀察員證實。所有已鑒定的變異均經(jīng)重復(fù)測序證實。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PCSK9基因5′UTR信息學(xué)分析

千人基因組數(shù)據(jù)庫(http://grch37.ensembl.org)中顯示中國漢族人群(包含中國北京漢族人和中國南方漢族人，共計208人)位于PCSK9基因5′UTR區(qū)上的SNP，只有一個常見SNP(Common SNP)，最小等位基因頻率(MAF)>0.05，即rs45448095(MAF為 0.095)。

2.2 構(gòu)建PCSK9基因5′UTR熒光素酶報告基因載體

PCSK9基因5′UTR編碼序列全長約為362 bp( NM_174936.3)，經(jīng)PCR擴增后，在2%瓊脂糖凝膠電泳中顯示362 bp處有明顯的目的條帶，電泳結(jié)果與理論結(jié)果一致，測序結(jié)果比對與原始序列吻合(圖1)。

注：A為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，Marker為標準分子量參照物，1～3為PCR擴增樣本；B為PCSK9 基因5′UTR區(qū)起始段DNA序列；C為PCSK9基因 5′UTR區(qū)終末段DNA序列。圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定及DNA測序驗證PCSK9基因 5′UTR區(qū)Fig.1 The PCSK9 gene was detected by agarose gel electrophoresis

2.3 基因多態(tài)性對 PCSK9 5′UTR活性的影響

在L02細胞中，PGL3-T(rs45448095-T)的熒光素酶活性較PGL3-C(rs45448095-C)顯著降低(-54.1%±2.3%,P<0.000 1)，HEK293T細胞中PGL3-T與PGL3-C亦出現(xiàn)相同的變化(-47.6%±1.4%,P<0.000 1)。圖2。

注：A為L02細胞，B為HEK293T細胞；(1)與PGL3-C比較， P < 0.000 1。圖2 293T細胞和L02細胞中rs45448095C/T的熒光報告基因結(jié)果Fig.2 Luciferase assay of expression of PCSK9 5'UTR constructs carrying rs45448095C/T in LO2 cells and 293T cells

2.4 rs45448095測序結(jié)果

Sanger法測序可以明顯分辨rs45448095基因多態(tài)性，見圖3。對照組人群rs45448095頻率為0.13，符合HW平衡；疾病組人群的rs45448095頻率為0.115，符合HW平衡；2組人群的基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.072)，見表1。

圖3 rs45448095測序結(jié)果Fig.3 DNA sequences results of rs45448095

表1 兩組人群的rs45448095基因多態(tài)性分布及等位基因頻率比較Tab.1 The distribution of rs45448095 gene polymorphisms and their frequencies

2.5 對照組人群rs45448095不同基因型與血漿血脂水平關(guān)系

對照組人群的rs45448095不同基因型分布影響LDL水平，每一個基因型的改變，減少血漿LDL水平的風(fēng)險的β(SE)為-0.353(0.158)，t=-2.237，P<0.05。不同基因型對血漿TG、TC、HDL水平無影響(P>0.05)，見表2。

表2 對照組人群rs45448095不同基因型對血漿血脂水平的影響Tab.2 Association of rs45448095 genotype with plasma lipid levels in control group

2.6 rs45448095不同基因型對冠心病相關(guān)危險度分析

對rs45448095基因多態(tài)性與冠心病風(fēng)險進行分析。采用不同遺傳特性模型分析結(jié)果顯示,隱性模型(CC+CT vs TT)、顯性模型(CC vs CT+TT)、加性模型(CC vs CT vs TT)，rs45448095基因多態(tài)性皆對冠心病風(fēng)險無影響(P>0.05)，見表3。

表3 rs45448095不同基因型對冠心病風(fēng)險的影響Tab.3 Association between rs45448095 variant with CHD

3 討論

本研究結(jié)果顯示，結(jié)合千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中常見的SNP(rs45448095)，對該SNP位點進一步進行簡單功能驗證，發(fā)現(xiàn)突變型(rs45448095-T)明顯影響PCSK9基因的表達活性；這種影響不管是在肝細胞系(L02)中，還是腎臟細胞系(293T)中都存在；同樣人群驗證中，亦發(fā)現(xiàn)rs45448095-T可以減低血漿LDL-C水平，但并未影響其他血脂水平以及冠心病風(fēng)險。

2003年發(fā)現(xiàn)PCSK9后，多項研究表明位于PCSK9基因碼區(qū)上的錯義突變、同義突變或多個突變組合的單體型都與血漿LDL-C水平強相關(guān)[10-11]。雖然沒有過多的研究表明，這些突變是如何調(diào)節(jié)血漿LDL-C水平。但所有研究結(jié)果都證實，不管是PCSK9基因上的功能獲得型突變還是功能缺失型突變都會影響LDL-C水平[6,12]。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)低血漿PCSK9水平人群同樣存在低血漿LDL-C水平[13]。由此可以認可PCSK9與血漿LDL-C的關(guān)系。鑒于此，研究工作者針對LDL-C代謝異常的患者研發(fā)了新的藥物——PCSK9單克隆抗體、PCSK9抑制劑。與設(shè)想中一樣，臨床試驗結(jié)果表明，抑制PCSK9后取得很好的降低LDL-C效果[14-15]。也有部分研究表明PCSK9上的突變在影響LDL-C后，可以影響冠心病或是缺血性卒中的風(fēng)險[16-17]。雖然關(guān)于PCSK9上的基因突變與LDL-C的關(guān)系的研究很多，但大多研究都是位于編碼區(qū)上的基因突變，關(guān)于基因領(lǐng)域研究新熱點——非編碼區(qū)上的基因突變未受到太多關(guān)注。而且深入探討PCSK9基因突變影響血脂水平機制的研究不多，尤其是關(guān)于PCSK9可受什么調(diào)控繼而影響LDL-C的研究并不多。越來越多的研究證實，非編碼區(qū)上的突變是可結(jié)合調(diào)控因子繼而對基因進行調(diào)控達到功能確實型或者功能缺失型突變，繼而影響基因的變達和影響血脂水平亦或疾病風(fēng)險[18-19]。

本研究發(fā)現(xiàn)首次證實，PCSK9基因5′UTR區(qū)的基因突變——rs45448095，是一個功能缺失型突變。細胞熒光報告基因?qū)嶒烇@示rs45448095-T突變后明顯減低了PCSK9表達活性，且在多個不同細胞系皆出現(xiàn)此結(jié)果。假設(shè)可能存在一個多組織高表達的調(diào)控因子可結(jié)合在此處調(diào)控PCSK9的表達，基因多態(tài)性破壞了這種結(jié)合。就像本實驗研究者之前曾經(jīng)證實的ChREBP基因3′UTR區(qū)基因多態(tài)性破壞了與miRNA的結(jié)合位點繼而影響ChREBP的表達[9]。不過遺憾的是，本研究曾運用多種生物信息學(xué)的方法并沒有預(yù)測到這個調(diào)控因子，無法證實實驗假設(shè)。與此同時，人群研究表明rs45448095-T突變影響人群血漿LDL-C水平，未影響TG、TC及HDL-C水平。表明PCSK9上的功能缺失型基因突變主要降低人群血漿LDL-C水平，這與前人研究一致[20]。但不同于前人的是，本研究沒有證實這種突變帶來了LDL-C降低的突變可降低冠心病風(fēng)險。不過鑒于本研究的樣本量過小、功能實驗不夠嚴謹，該研究無法充分證實rs45448095是否影響冠心病風(fēng)險，rs45448095-T突變型是否具有類似PCSK9抑制劑的作用。后續(xù)仍需要更大的臨床研究以及更多的功能實驗證實研究者的假想。但本研究為后續(xù)研究提供了一個新方向，亦降脂治療提供了一個新可能。

綜上所述，PCSK9基因5′UTR區(qū)rs45448095基因多態(tài)性可以顯著降低中國漢族人血漿LDL-C水平，本研究進一步證實了PCSK9表達與LDL-C的關(guān)系，可為PCSK9抑制劑的功效研究提供依據(jù)。