香花崖豆藤組織培養(yǎng)技術(shù)*

陳穎樂(lè) 王彩云 王 頌 徐巧林 余玉娟 黃文妍 曾 雷

(廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520)

香花崖豆藤（Millettia dielsiana）為豆科崖豆藤屬攀援灌木，別名山雞血藤、血風(fēng)、血風(fēng)根、狄氏雞血藤。產(chǎn)于陜西（南部）、甘肅（南部）及長(zhǎng)江流域以南，越南、老撾也有分布[1,2]。其葉具有明顯的季向變化，其花艷麗多姿，觀賞價(jià)值高[3]，常用作花廊、假山、墻垣的攀援綠化[4]。香花崖豆藤含有異黃酮類(lèi)[5]、異黃烷類(lèi)[6]、三萜類(lèi)[7]活性成分，中醫(yī)以其根或藤莖入藥，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)功效，主治腰膝疼痛、手腳酸麻、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)等癥狀[8-11]。香花崖豆藤用途廣泛，逐步受到人們的喜愛(ài)，苗木的需求量逐年增加。

黃艷寧等人[12]對(duì)香花崖豆藤的繁殖技術(shù)進(jìn)行研究，測(cè)定了香花崖豆藤的種子萌發(fā)情況，發(fā)芽率明顯不高；還發(fā)現(xiàn)香花崖豆藤生根率普遍不高，且不同時(shí)期差異不大[13]?，F(xiàn)有的研究?jī)H對(duì)香花崖豆藤種子進(jìn)行了組織培養(yǎng)與快速繁殖[14]，而以其莖段為材料的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。種子材料的性狀存在遺傳分化，而直接采集自?xún)?yōu)良植株的莖段材料能完整保存優(yōu)良特性，從而有利于加速實(shí)現(xiàn)香花崖豆藤良種化。因此本研究以香花崖豆藤優(yōu)良植株的莖段為外植體材料建立良種組培快繁體系，滿足市場(chǎng)需求的同時(shí)，也為更好地開(kāi)發(fā)與利用香花崖豆藤奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇生長(zhǎng)健壯的香花崖豆藤優(yōu)良植株，采集帶有腋芽的半木質(zhì)化莖段，置于流水沖洗1 h 后，濾紙吸干水分；在無(wú)菌操作間內(nèi)用75%的酒精浸泡30 s，0.1%的升汞(HgCl2)浸泡15 min，消毒后用無(wú)菌水清洗5-8 次，接種在MS+6-BA 0.2 mg/ L培養(yǎng)基，22 d 轉(zhuǎn)接1 次；無(wú)菌芽連續(xù)轉(zhuǎn)接3 次后作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 繼代增殖試驗(yàn) 將無(wú)菌芽去頂后保留長(zhǎng)1.5～2.0 cm，接入MS 培養(yǎng)基、添加不同濃度NAA(0.1、0.2 mg·L-1)、6-BA (0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1)的增殖培養(yǎng)基中。采用雙因素試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)NAA和6-BA 濃度篩選試驗(yàn)，NAA 為A 因素，6-BA 為B 因素，3 次重復(fù)，每個(gè)處理30 瓶，每瓶接1 個(gè)芽。在恒溫25 ℃、3 000 lux 熒光燈照射8 h，培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)芽的增殖情況。

1.2.2 無(wú)菌苗生根試驗(yàn) 將長(zhǎng)2～2.5 cm 的無(wú)菌苗，接種于1/2 MS 培養(yǎng)基，添加不同濃度IBA、NAA、GGR6 至培養(yǎng)基中。采用L9(34)正交試驗(yàn)（表1），篩選香花崖豆藤無(wú)菌苗最佳生根激素濃度組合。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶接入10 個(gè)莖段。在恒溫25 ℃、3 000 lux熒光燈照射8 h 的環(huán)境中培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)入自然散射光培養(yǎng)15 d，從無(wú)污染的培養(yǎng)瓶中夾出生根苗，每個(gè)處理隨機(jī)抽取100 株瓶苗，統(tǒng)計(jì)生根率確定最佳生根培養(yǎng)基配方。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用SPSS 21 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。通過(guò)方差分析和多重比較揭示每個(gè)處理間增殖倍數(shù)的差異顯著性，多重比較采用Duncan方法。而正交試驗(yàn)采用極差分析，篩選最佳生根激素濃度組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 繼代增殖試驗(yàn)

因素A 和因素B 各水平間增殖倍數(shù)均差異顯著(P＜0.05)(表2)，因素A 中A1(NAA 0.1 mg·L-1)的增殖倍數(shù)比A2 高16.51%，因素B 間4 個(gè)水平隨著6-BA 濃度的升高，增殖倍數(shù)也逐漸增加，當(dāng)6-BA 濃度為0.8 mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)最大為4.20，比0.2 mg·L-1時(shí)高65%(表3)。因素A 和因素B 不存在顯著的交互作用(表2)，但在8 個(gè)組合中A1B4 增殖倍數(shù)最大，為4.27。因此，NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1MS 為香花崖豆藤增殖培養(yǎng)基激素配比。

表2 香花崖豆藤腋芽增殖培養(yǎng)的方差分析Table 2 Analysis of variance for axillary bud propagation of M.dielsiana

表3 香花崖豆藤不同因素間增殖倍數(shù)的差異Table 3 The difference of multiplication times between different factors of M.dielsiana

2.2 無(wú)菌苗生根培養(yǎng)

由極差分析結(jié)果可知(表4)，3 個(gè)因素的極差由大到小依次排列為IBA ＞NAA ＞GGR6。這說(shuō)明IBA 對(duì)生根率的影響最大，其次是NAA，GGR6 影響最小。比較每個(gè)因素的各水平均值可知，IBA 為K2＞K3＞K1，NAA 為K2＞K3＞K1，GGR6 為K3＞K2＞K1，可以看出5號(hào)試驗(yàn)生根激素組合優(yōu)于其他組合，并且根基部愈傷組織少滿足生產(chǎn)需要。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test

3 討論與結(jié)論

植物離體器官的再生不僅與外植體的來(lái)源有關(guān)，還受外部培養(yǎng)條件的影響[15]，其中不同類(lèi)型不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)離體器官的再生有重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1MS 為香花崖豆藤增殖培養(yǎng)基激素最適配比。6-BA 和NAA 結(jié)合使用對(duì)香花崖豆藤芽的分化與增殖有促進(jìn)作用，這與黃艷寧等[14]的研究結(jié)果相似。研究表明IBA、NAA、IAA 常用于組培苗生根的生長(zhǎng)素，但I(xiàn)AA 儲(chǔ)存時(shí)容易降解或氧化，因此該試驗(yàn)選擇了IBA 和NAA 進(jìn)行香花崖豆藤的生根試驗(yàn)。黃艷寧等[14]采用種子進(jìn)行萌發(fā)進(jìn)行香花崖豆藤的組織培養(yǎng)，生根率為80%，而本實(shí)驗(yàn)研究高于其生根率為86%，這可能與外植體材料的選擇不同有關(guān)。

本研究通過(guò)雙因素試驗(yàn)對(duì)香花崖豆藤莖段進(jìn)行增殖培養(yǎng)，確定NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1MS 為香花崖豆藤增殖培養(yǎng)基激素最適配比。采用正交試驗(yàn)對(duì)無(wú)菌苗生根試驗(yàn)進(jìn)行了 優(yōu) 化，在IBA 0.5 mg·L-1、NAA 0.6 mg·L-1、GGR6 mg·L-1時(shí)，香花崖豆藤無(wú)菌苗的生根率為86.0%，且愈傷組織少。本研究可為香花崖豆藤良種的快速擴(kuò)繁及工廠化育苗提供參考。