基于窄內(nèi)徑多孔層毛細(xì)管開管柱的納流高效液相色譜用于N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離

李若男, 王利娟, 張東堂, 王亞楠, 郭廣生, 汪夏燕

(環(huán)境安全與生物效應(yīng)卓越中心, 綠色催化與分離北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工系, 北京 100124)

多孔層開管(PLOT)毛細(xì)管柱是20世紀(jì)50年代末由Golay提出的一種重要的色譜微柱類型[1],目前已被廣泛用于液相色譜分離。相比于毛細(xì)管填充柱和整體柱,PLOT柱具有更好的滲透性,且更易進(jìn)行微型化[2]。隨著其微型化的發(fā)展,PLOT柱已成為生命科學(xué)領(lǐng)域樣品分析的重要工具。有研究報(bào)道[3,4],內(nèi)徑為10 μm的聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)PLOT柱已成功制備,并用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。隨后,Li等[5]將這種PLOT柱用于全血中稀有細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

目前,用于制備PLOT柱的方法主要有溶膠-凝膠法、原位熱引發(fā)聚合法和原位光引發(fā)聚合法等[6-10]。其中,原位光引發(fā)聚合法常用于粗內(nèi)徑PLOT的制備,溶膠-凝膠法和原位熱引發(fā)聚合法已被廣泛用于內(nèi)徑為25 μm以下的NPLOT柱的制備,但是目前所報(bào)道的這些方法聚合時(shí)間均較長,聚合時(shí)間是影響PLOT柱形貌的重要因素之一[11]。

氨基酸是一類重要的手性分子,是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元,也是維持有機(jī)體生理機(jī)能的關(guān)鍵分子[12]。氨基酸的手性分離主要依賴于手性固定相。目前,多種奎尼丁類手性固定相已被用于N-衍生化氨基酸對(duì)映體、N-衍生化二肽立體異構(gòu)體等的分離,具有較好的分離效率和手性選擇性[13-17]。文獻(xiàn)所報(bào)道的制備奎尼丁類手性固定相色譜柱所需要的時(shí)間大都為12 h[15-17],甚至更長[13,14],因而,需要進(jìn)一步發(fā)展快速制備高性能的奎尼丁類手性固定相NPLOT柱的方法。

本研究以O(shè)-[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基氨基甲?；鵠-10,11-二氫奎尼丁(MQD)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑,甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)為共聚單體,環(huán)己醇和正十二烷醇為致孔劑,偶氮二異丁腈(AIBN)和2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(DMPA)為引發(fā)劑,采用原位熱引發(fā)聚合法制備窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱,將聚合時(shí)間縮短至3 h。隨后,將熱聚合3 h制備的PLOT柱用于N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離,在2 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體的快速分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Model 510色譜泵(美國Waters公司); Nova NanoSEM 430超高分辨率場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡(美國FEI公司); SAPPHIRE 800 CE毛細(xì)管紫外檢測(cè)器(捷克Ecom公司); V2008數(shù)據(jù)采集卡(上海萬象儀器有限公司); Barnstead Nanopure超純水系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司); 6 μm i.d.(360 μm o. d.,聚酰亞胺外涂層)的熔融石英毛細(xì)管(美國Polymicro Technologies公司);孔徑為0.22 μm的針頭過濾器(上海德里安儀器有限公司);不銹鋼密封瓶(北京工業(yè)大學(xué)校加工廠)。

HEMA、EDMA、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)和DMPA(百靈威科技有限公司);正十二烷醇(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司);甲醇和乙腈(色譜純,Thermo Fisher Scientific公司);丙酮(北京化工廠);氫氧化鈉、冰醋酸和AIBN(福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司);環(huán)己醇(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所);乙酸銨(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);O-9-[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基氨基甲?；鵠-10,11-二氫奎尼丁(MQD)、間氯苯甲?；?甲硫氨酸(m-ClB-DL-Met)、間氯苯甲酰基-丙氨酸(m-ClB-DL-Ala)、3,5-二甲氧基苯甲酰基-亮氨酸(3,5-DMB-DL-Leu)、3,5-二氯苯甲?；?纈氨酸(3,5-DClB-DL-Val)、3,5-二氯苯甲酰基-色氨酸(3,5-DClB-DL-Trp)由暨南大學(xué)江正瑾教授課題組提供。實(shí)驗(yàn)前,采用孔徑為0.22 μm的針頭過濾器過濾使用的各種溶液。

1.2 Poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的制備

采用原位熱引發(fā)制備窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱。首先,截取一定長度的6 μm i.d.毛細(xì)管,依次使用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水、丙酮沖洗毛細(xì)管3、2、1 h,經(jīng)氮?dú)獯蹈?。配制體積比為1∶1的γ-MAPS和丙酮的混合溶液,將混合溶液注入毛細(xì)管后封堵毛細(xì)管兩端,在暗處反應(yīng)24 h后使用丙酮沖洗毛細(xì)管,隨后用氮?dú)獯蹈擅?xì)管備用。

其次,配制含有3.98% (質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同) MQD、7.98% EDMA、7.92% HEMA、40.00%正十二烷醇、39.77%環(huán)己醇、0.35% AIBN的熱聚合溶液,經(jīng)振蕩、超聲、除氧后注入上述內(nèi)表面硅烷化后的6 μm i.d.毛細(xì)管,在顯微鏡下觀察毛細(xì)管中聚合物溶液的液面,待液面到達(dá)距毛細(xì)管另一末端一定距離時(shí),立刻停止注入溶液,封堵毛細(xì)管兩端,將6 μm i.d.毛細(xì)管放入60 ℃水浴中反應(yīng)。毛細(xì)管中未注入聚合溶液的部分在隨后色譜實(shí)驗(yàn)中作為檢測(cè)窗口使用。反應(yīng)完成后用甲醇沖洗毛細(xì)管柱約8 h,即可制得窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱。

1.3 窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)NPLOT柱的橫截面進(jìn)行表征,觀察其形貌及多孔層厚度。

1.4 納流高效液相色譜-紫外檢測(cè)系統(tǒng)

N-衍生化氨基酸對(duì)映體在自行搭建的納流高效液相色譜-紫外(nano-HPLC-UV)檢測(cè)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)分離?；贜PLOT柱的nano-HPLC-UV系統(tǒng)由氮?dú)馄俊⑷芤浩?、NPLOT柱、毛細(xì)管紫外檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集卡和電腦等部分組成,見圖1。

圖 1 納流高效液相色譜-紫外檢測(cè)系統(tǒng)的示意圖Fig. 1 Scheme of nano-HPLC-UV detection system PLOT: porous layer open tubular; DAQ: data acquisition.

圖 2 熱聚合不同時(shí)間制備得到的poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的SEM圖Fig. 2 SEM images of poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT column prepared by in-situ thermal-initiated polymerization for different durations a. bare capillary; b. 3 h; c. 6 h; d. 9 h.

1.5 色譜條件

分別稱取適量m-ClB-DL-Ala、m-ClB-DL-Met、3,5-DMB-DL-Leu,加入甲醇作為溶劑,振蕩混合均勻,配制成1.0 g/L的樣品溶液。分別稱取適量3,5-DClB-DL-Val、3,5-DClB-DL-Trp,加入甲醇作為溶劑,振蕩混合均勻,配制成10.0 g/L的樣品溶液,于4 ℃下保存?zhèn)溆?其余低濃度的樣品溶液均由高濃度的樣品溶液稀釋而成。采用自制的NPLOT柱為色譜柱,體積比為4∶1的乙腈-0.1 mol/L乙酸銨溶液(pH=5.3)為流動(dòng)相,紫外檢測(cè)波長為254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的表征

聚合時(shí)間是影響PLOT柱中多孔層厚度的重要因素之一,聚合時(shí)間過長易導(dǎo)致PLOT柱的堵塞,尤其對(duì)于NPLOT柱[11]。因此,本研究采用原位熱引發(fā)聚合法在6 μm i.d.的毛細(xì)管中制備poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱,考察了聚合時(shí)間對(duì)于多孔層厚度的影響,聚合時(shí)間分別為3、6和9 h制備得到的NPLOT柱的形貌見圖2。圖2a是裸毛細(xì)管的SEM圖,通過測(cè)量可知標(biāo)識(shí)為6 μm i.d.的毛細(xì)管的實(shí)際內(nèi)徑為6.76 μm。圖2b、c、d分別是熱聚合3、6和9 h制備得到的NPLOT柱的SEM圖,隨著熱聚合時(shí)間的延長,多孔層的厚度逐漸增加,同時(shí)NPLOT柱由暢通變?yōu)槎氯?。熱聚? h和6 h制備得到的NPLOT柱的多孔層的厚度較為均勻,約為103±51 nm和210±51 nm,而熱聚合9 h制備得到的NPLOT柱多出現(xiàn)堵塞。圖3是熱聚合3 h制備得到的NPLOT柱的多孔層的放大圖,在聚合物層中分布有納米孔。因此,當(dāng)熱聚合時(shí)間縮短至3 h時(shí),便可以獲得厚度均勻、形貌較好的NPLOT柱,熱聚合時(shí)間的縮短能夠有效縮短N(yùn)PLOT柱的制備周期。

圖 3 熱聚合3 h的窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co- EDMA) PLOT柱的多孔層Fig. 3 SEM image of porous layer in poly(MQD-co- HEMA-co-EDMA) PLOT columns with narrow inner diameter by heating for 3 h

2.2 N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離

實(shí)驗(yàn)中考察了所制備的3種NPLOT柱對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離性能,結(jié)果表明:熱聚合9 h制備得到的NPLOT柱多出現(xiàn)堵塞,因此未對(duì)其進(jìn)行分離表征;熱聚合3 h和6 h的NPLOT柱都具有較好形貌,但是獲得的多孔層厚度不同,導(dǎo)致分離柱的柱容量不同。不同性質(zhì)和濃度的分析物所適用的分離柱不盡相同,對(duì)于N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離,聚合時(shí)間為6 h的NPLOT柱的分離時(shí)間大于6 min,而聚合時(shí)間為3 h的NPLOT柱僅在2 min內(nèi)就實(shí)現(xiàn)了基本分離。針對(duì)快速分離而言,熱聚合3 h的NPLOT柱已完全滿足分離條件,因此文中僅對(duì)聚合3 h所制備的柱子進(jìn)行了討論。

圖 4 N-衍生化氨基酸對(duì)映體的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of N-derivatized amino acid enantiomers Chromatographic column: poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT column, 6 μm i.d., total length 44.60 cm, effective length 40.70 cm; polymerization time: 3 h; sampling condition: 1.38 MPa, 20 s; sample concentration: 1.0 g/L; separation condition: 6.89 MPa; mobile phase flow rate: 32.24 nL/min.

圖 5 N-衍生化氨基酸對(duì)映體混合物的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of N-derivatized amino acid enantiomers Sample: a. 10.0 g/L 3,5-DClB-DL-Val; b. 10.0 g/L 3,5-DClB-DL-Trp; c. complex of 5.0 g/L 3,5-DClB-DL-Trp and 5.0 g/L 3,5-DClB-DL-Val. Chromatographic column: poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT column, 6 μm i.d., total length 59.40 cm, effective length 54.20 cm; polymerization time: 3 h; sampling condition: 1.38 MPa, 20 s; separation condition: 1.38 MPa; mobile phase flow rate: 5.00 nL/min. 1. methanol; 2.3,5-DClB-L-Val; 3. 3,5-DClB-L-Trp; 4. 3,5-DClB-D-Val; 5. 3,5-DClB-D-Trp.

為表征窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的性能,本研究選用熱聚合3 h制備的poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱對(duì)單對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體及兩對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體的混合物進(jìn)行了分離(見圖4和圖5)。

N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離度(R)、理論塔板數(shù)(N)、保留因子(k)、手性選擇性(α)可根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算:

(1)

其中,tR1和tR2分別是分析物的第1個(gè)色譜峰和第2個(gè)色譜峰的保留時(shí)間,W1/2(1)和W1/2(2)分別是第1個(gè)色譜峰和第2個(gè)色譜峰的半峰寬。

(2)

其中,tR是色譜峰的保留時(shí)間,W1/2是色譜峰的半峰寬。

(3)

其中,t0是溶劑峰的保留時(shí)間,tR是分析物色譜峰的保留時(shí)間。

(4)

其中,k1和k2分別是分析物的第1個(gè)和第2個(gè)色譜峰的保留因子。

2.2.1單對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離

采用6 μm i.d. poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱對(duì)1.0 g/Lm-ClB-DL-Met、m-ClB-DL-Ala和3,5-DMB-DL-Leu進(jìn)行手性分離,流動(dòng)相的流速為32.24 nL/min,進(jìn)樣量僅為皮升級(jí)別。圖4是m-ClB-DL-Met、m-ClB-DL-Ala和3,5-DMB-DL-Leu的色譜圖。

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道,采用以MQD為手性選擇劑的色譜柱對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體進(jìn)行分離時(shí),L型氨基酸總是先于D型氨基酸被洗脫出來。如圖4所示,第一個(gè)色譜峰是溶劑甲醇的色譜峰,第二個(gè)和第三個(gè)色譜峰分別是L型和D型氨基酸的色譜峰。在1.5 min內(nèi),m-ClB-DL-Ala和3,5-DMB-DL-Leu即可實(shí)現(xiàn)分離,分離度分別是1.52和1.25,而在2 min內(nèi)3種N-衍生化氨基酸對(duì)映體均可在有效長度為40.70 cm的PLOT柱上實(shí)現(xiàn)分離,分離度、理論塔板數(shù)、保留因子和手性選擇性見表1。

表 1 N-衍生化氨基酸對(duì)映體的分離度、理論塔板數(shù)、保留因子和手性選擇性Table 1 Resolutions, plate numbers, retention factors, and enantioselectivity of N-derivatized amino acid enantiomers

2.2.2N-衍生化氨基酸對(duì)映體混合物的分離

為進(jìn)一步表征窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的分離性能,采用該色譜柱對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體3,5-DClB-DL-Trp和3,5-DClB-DL-Val及其混合物進(jìn)行分離,流動(dòng)相流速為5.00 nL/min,進(jìn)樣量僅為皮升級(jí)別,分離結(jié)果見圖5。通過與單對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體的色譜圖的對(duì)比可知,1號(hào)色譜峰均為用作樣品溶劑的甲醇的色譜峰,2～5號(hào)色譜峰依次屬于3,5-DClB-L-Val、3,5-DClB-L-Trp、3,5-DClB-D-Val、3,5-DClB-D-Trp,其理論塔板數(shù)分別為1 890、1 717、4 899、4 527 plates/m,兩峰之間的分離度依次為3.08、3.68、5.88。根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道,N-衍生化氨基酸對(duì)映體中的N-衍生基團(tuán)和氨基酸側(cè)鏈均可能與手性選擇劑相互作用,有助于其手性識(shí)別。當(dāng)衍生基團(tuán)相同時(shí),氨基酸側(cè)鏈的大小和親油性可能影響其在色譜柱上的保留順序,同時(shí)N-衍生化氨基酸中帶負(fù)電的羧基可能與MQD中帶正電的叔氮之間存在靜電相互作用[18]。而N-衍生基團(tuán)中的苯環(huán)可能與MQD中喹啉環(huán)之間存在π-π相互作用。此外,N-衍生化氨基酸對(duì)映體中的氫可能與奎尼丁中的氧存在氫鍵相互作用。以上結(jié)果表明,熱聚合3 h制備的poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱對(duì)單對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體及兩對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體的混合物均可以達(dá)到較好的基線分離效果。

3 結(jié)論

本研究考察了不同熱聚合時(shí)間下制備的窄內(nèi)徑poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的形貌和多孔層的厚度,熱聚合時(shí)間為3 h和6h得到的NPLOT柱形貌較好、厚度均一。熱聚合3 h的NPLOT柱對(duì)單對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體及兩對(duì)N-衍生化氨基酸對(duì)映體混合物的分離效果較好。與粗內(nèi)徑的PLOT柱相比,NPLOT柱更有利于分析物與固定相間的相互作用,降低分離柱的渦流擴(kuò)散效應(yīng)和傳質(zhì)阻力,進(jìn)而提高分離柱的柱效和分離能力。因此,NPLOT柱可以在更薄的多孔層厚度下實(shí)現(xiàn)較好的樣品分離效果。NPLOT柱還具有制備周期短、消耗樣品量低的特點(diǎn),這將有助于NPLOT柱在生命科學(xué)研究中的進(jìn)一步應(yīng)用。

致謝 感謝暨南大學(xué)江正瑾教授課題組為我們提供MQD和N-衍生化氨基酸對(duì)映體樣品。