EAAT2基因多態(tài)性對帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人疼痛敏感性的影響*

華 敏 殷 琴 劉 貝 孫 凱 陳立平 許 恒 申 文△

（1徐州醫(yī)科大學(xué) 江蘇省麻醉與疼痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，徐州221004； 2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，徐州221002）

帶狀皰疹 (herpes zoster, HZ) 是潛伏性的水痘帶狀皰疹病毒再激活的結(jié)果，其典型特征是沿感覺神經(jīng)在相應(yīng)節(jié)段引起皰疹，并伴有疼痛。帶狀皰疹最常見的并發(fā)癥是帶狀皰疹后神經(jīng)痛 (postherpetic neuralgia, PHN)[1]，PHN是一種典型的慢性神經(jīng)病理性疼痛，病程遷延難愈，常表現(xiàn)為痛覺過敏和痛覺超敏，伴有情感及睡眠障礙，能極大地限制日?；顒樱档筒∪说纳钯|(zhì)量,嚴重者甚至有自殺傾向。帶狀皰疹后神經(jīng)痛的治療目的首要的是盡早有效地控制疼痛，但是目前臨床上對于帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的疼痛控制仍不盡人意[2]。

已經(jīng)有越來越多的研究表明疼痛敏感性的個體差異可能與基因多態(tài)性相關(guān)。許多神經(jīng)遞質(zhì)參與神經(jīng)病理性疼痛形成與發(fā)展，其中谷氨酸是影響突觸可塑性，參與中樞敏化的重要神經(jīng)遞質(zhì)，是誘發(fā)疼痛形成和持續(xù)的重要因素[3]。谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(glutamate transporter-1, GLT-1) ，也稱為興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體2 (excitatory amino acid transporter 2,EAAT2）,負責(zé)大腦中約90%的谷氨酸再攝取，在維持突觸間隙的谷氨酸穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。在大鼠的慢性疼痛模型中，脊髓中GLT-1表達下調(diào)，這表明GLT-1參與了慢性疼痛的發(fā)展[4～6]。已有多項研究表明通過上調(diào)脊髓GLT-1，降低谷氨酸濃度可以減輕痛覺過敏[7,8]。

有研究表明 EAAT2基因啟動子區(qū)(A-181C,rs4354668)單核苷酸多態(tài)性影響GLT-1的表達，從而影響血漿谷氨酸濃度[9,10]。但是目前并沒有直接的研究證據(jù)表明EAAT2基因多態(tài)性與神經(jīng)病理性疼痛病人疼痛敏感性之間的相關(guān)性。帶狀皰疹后神經(jīng)痛是一種典型的疼痛敏感性異常的疾病，本研究首次探討EAAT2基因多態(tài)性與帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人疼痛敏感性之間的相關(guān)性，為臨床神經(jīng)病理性疼痛的治療提供參考。

方 法

1.一般資料

選擇2018年1月至2018年8月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科住院確診為帶狀皰疹后神經(jīng)痛的病人128例（男66例、女62例，年齡42～85歲），并納入同期該院的健康體檢者116例作為對照組（男60例，女56例，年齡38～82歲）。所有受試者均為自然人群，且無血緣關(guān)系。兩組間的年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究已通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理號：XYFY2018-KL040-01），并與受試者簽署知情同意書。

排除標(biāo)準：①中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或精神性疾病者；②合并其他急慢性疼痛者；③患有嚴重心腦血管疾病者；④嚴重肝、腎功能損害者；⑤不能進行疼痛評估者。

剔除標(biāo)準：①突發(fā)其他急性疾病者；②帶狀皰疹繼發(fā)于其他疾病，如惡性腫瘤等；③治療過程中數(shù)據(jù)采集不全者。本試驗過程中共剔除了12例病人，失訪率約10%。

2.方法

（1）評估：治療開始前記錄病人的疼痛數(shù)字評分(numerical rating scale, NRS)：0分為無痛，1～3分輕度疼痛，4～6分中度疼痛，7～10分重度疼痛，根據(jù)病人的疼痛評分，分為輕度、中度和重度疼痛亞組。本試驗中的帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人NRS評分均在4分以上，故無輕度疼痛亞組，中度和重度疼痛亞組例數(shù)分別為91例和37例。對于中重度疼痛病人采用加巴噴丁及阿片類藥物進行鎮(zhèn)痛治療（NRS評分≥4分開始使用阿片類藥物），NRS評分降低≥50%為明顯緩解[2]。采用每日等效口服嗎啡劑量 (morphine equivalent daily dose, MEDD)對阿片類藥物用量進行統(tǒng)計，換算公式為曲馬多600 mg/d =羥考酮30 mg/d =芬太尼透皮貼4.2 mg/72 h = 嗎啡60 mg/d[11]。

（2）基因分型：抽取研究對象外周靜脈血樣2 ml，DNA提取采用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司），采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)進行基因分型。PCR引物設(shè)計由生工生物工程（上海）公司設(shè)計，引物序列:正向引物5’-CTGCCACCTGTGCTTTGCT-3’，反向引物5’-GAGGGATCGCCTGCAAATCC-3’。PCR反應(yīng)體系同普通PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，然后進行35個循環(huán)（95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s），72℃終末延伸10 min，擴增產(chǎn)物長為210 bp。將PCR產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶NciI[12]進行酶切，酶切反應(yīng)總體系為50 μl,包括PCR 產(chǎn)物 10 μl、內(nèi)切酶 1 μl、10×CutSmart Buffer 5 μl,滅菌水34 μl。此反應(yīng)體系置于37℃的恒溫箱中酶切1～16 h，反應(yīng)終止后用2% 瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓120 V，時間45 min，采用全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照確定基因型。rs4354668位點野生型純合子(AA)為210 bp，突變型雜合子(AC)為210，110和100 bp，突變型純合子(CC)為110和100 bp。在瓊脂糖凝膠電泳圖上難以觀察區(qū)分110 bp和100 bp條帶，但并不影響基因型的判讀（見圖1）。隨機抽取不同基因型DNA標(biāo)本的PCR產(chǎn)物寄送上海生工公司進行測序（見圖2），以驗證PCRRFLP方法基因型鑒定的準確性。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(D)，組間比較用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；非正態(tài)分布資料采用M (P25，P75)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料和Hardy-Weinberg平衡采用X2檢驗。分析爆發(fā)痛發(fā)生相關(guān)的因素采用單因素分析及二元 Logistic回歸模型的多因素分析。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Hardy-Weinberg遺傳平衡

圖1 rs4354668位點基因型凝膠電泳圖譜Fig.1 Gel electrophoresis of rs4354668 genotype Note: 1: wild type homozygous AA; 2,4,5:mutant heterozygous AC; 3: mutant homozygous CC; M1: DNA marker I

帶狀皰疹后神經(jīng)痛組納入受試者128例，經(jīng)檢測EAAT2 -rs4354668位點AA/AC/CC基因型分別為11/52/65例，等位基因A頻率為28.91%；對照組納入健康志愿者116例，AA/AC/CC基因型分別為9/51/56例，等位基因A頻率為29.74%。兩組研究對象 EAAT2 -rs4354668 基因型及等位基因分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，說明研究對象具有良好的群體代表性。

2.帶狀皰疹后神經(jīng)痛組與對照組基因型及等位基因分布的比較

帶狀皰疹后神經(jīng)痛組與對照組相比基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05，見表1）。

3.帶狀皰疹后神經(jīng)痛組不同亞組病人的一般資料和臨床特征的比較

（1）不同疼痛程度病人的一般資料和臨床特征比較：不同疼痛程度帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的一般資料和臨床特征比較，結(jié)果顯示中度和重度疼痛亞組病人年齡比較有顯著差異，重度疼痛亞組病人年齡明顯高于中度疼痛亞組病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.043)，而性別，體重指數(shù)，受累神經(jīng)節(jié)段，合并癥未見明顯差異（P> 0.05，見表2）。

（2）不同基因型及等位基因病人的一般資料和臨床特征比較：不同基因型及等位基因帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的一般資料和臨床特征比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05，見表3）。

4.EAAT2-rs4354668位點基因多態(tài)性對帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人疼痛程度的影響

不同疼痛程度帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05，見表4）。

5.EAAT2-rs4354668位點基因多態(tài)性對帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人阿片類藥物用量的影響

在中度及重度疼痛亞組中，EAAT2基因rs4353668位點各基因型病人之間阿片藥物用量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05，見表5）。

圖2 rs4354668位點基因型測序圖Fig.2 Genotype sequencing diagram of rs4354668

6.影響帶狀皰疹后神經(jīng)痛病病人爆發(fā)痛發(fā)生的臨床病理特征單因素分析

把本研究中可能影響帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人爆發(fā)痛發(fā)生的混雜因素，包括年齡、性別、受累神經(jīng)節(jié)段、合并癥（高血壓、冠心病、糖尿病）及EAAT2-rs4354668位點基因型等對爆發(fā)痛發(fā)生的影響分別進行單因素分析，結(jié)果顯示均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05，見表6）。將P< 0.2的影響因素即年齡和受累神經(jīng)節(jié)段進一步納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果示無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05，見表7）。

討 論

脊髓背角神經(jīng)元谷氨酸能系統(tǒng)的過度激活是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下神經(jīng)元異常激活的關(guān)鍵機制。盡管臨床和動物研究數(shù)據(jù)表明谷氨酸能系統(tǒng)參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，但與谷氨酸能系統(tǒng)相關(guān)的遺傳多態(tài)性對神經(jīng)病理性疼痛的疼痛敏感性的可能貢獻尚未確定。EAAT2基因定位于11p13-p12，長168.8 kb，由16個外顯子組成，其啟動子區(qū)的序列分析顯示rs4354668 (A-181C)位點的單核苷酸突變使本來應(yīng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件激活蛋白-2 (AP-2)位點的序列消失，而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合元件GC結(jié)合因子2 (GCF2)的新序列，降低GLT-1的表達，使攜帶突變的等位基因C的病人顯示更高的血漿谷氨酸濃度[9]。已有多項動物實驗表明通過調(diào)節(jié)GLT-1水平，可以影響疼痛敏感性。帶狀皰疹后神經(jīng)痛是一種臨床上常見的神經(jīng)病理性疼痛，伴有明顯的痛覺敏感，重度疼痛病人還常伴有爆發(fā)痛，由此本研究提出EAAT2基因多態(tài)性可能影響帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人疼痛敏感性的假設(shè)。

表1 rs4354668位點基因型及等位基因頻率分布[n (%)]Table 1 Distribution of genotype and allele frequency of rs4354668 [n (%)]

表2 不同疼痛程度帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的一般資料和臨床特征(D)Table 2 General data and clinical features of the patients with different levels of pain (D)

表2 不同疼痛程度帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的一般資料和臨床特征(D)Table 2 General data and clinical features of the patients with different levels of pain (D)

*P < 0.05

中度疼痛Moderate pain (n = 91) 重度疼痛Severe pain (n = 37) P年齡Age (years) 68.0±10.3 72.2±11.0 0.043*性別Gender男/女Male/Female 48/43 18/19 0.674體質(zhì)指數(shù)BMI (kg/m2) 23.3±3.2 23.6±2.6 0.708受累神經(jīng)節(jié)段Nerve segment顱+頸/胸/腰Cranial + Cervical/Thoracic/Lumbar 30/54/7 16/19/2 0.532合并癥Comorbidity高血壓/冠心病/糖尿病Hypertension/Coronary disease/ Diabetes 34/13/17 10/7/10 0.370

表3 不同基因型及等位基因帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的一般資料和臨床特征(D)Table 3 General data and clinical features of the patients with different genotypes and alleles (D)

表3 不同基因型及等位基因帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的一般資料和臨床特征(D)Table 3 General data and clinical features of the patients with different genotypes and alleles (D)

特征Features 基因型Genotype P 等位基因攜帶者Allele carrier P AA AC CC A C年齡 Age (years) 67.2±8.6 69.1±11.1 69.5±10.7 0.807 68.8±10.7 69.4±10.8 0.748性別Gender男/女Male/Female 8/3 28/24 30/35 0.241 36/27 58/59 0.332體質(zhì)指數(shù)BMI (kg/m2) 23.2±3.3 23.6±3.0 23.3±3.1 0.863 23.5±3.1 23.4±3.1 0.844受累神經(jīng)節(jié)段Nerve segment顱+頸/胸/腰Cranial + Cervical/Thoracic/Lumbar 3/7/1 18/30/4 25/36/4 0.925 21/37/5 43/66/8 0.886合并癥Comorbidity高血壓/冠心病/糖尿病Hypertension/Coronary disease/Diabetes 4/3/0 18/7/9 22/10/18 0.286 22/10/9 40/17/27 0.493

表4 不同疼痛程度帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的基因型和等位基因分布的比較 [n (%)]Table 4 Comparison of the genotype and allele distribution among patients with different levels of pain [n (%)]

表5 中、重度疼痛帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人不同基因型間阿片類藥物用量比較Table 5 Comparisons of opioid doses among different genotypes of moderate and severe pain patients

表6 影響帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人爆發(fā)痛發(fā)生的臨床特征單因素分析Table 6 Univariate analysis of clinic features of breakthrough pain (BTP) in patients with postherpetic neuralgia

表7 影響帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人爆發(fā)痛發(fā)生的多因素Logistic 回歸分析Table 7 Multivariate Logistic regression analysis of breakthrough pain (BTP) in patients with postherpetic neuralgia

本研究結(jié)果表明，不同疼痛程度帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人EAAT2基因的啟動子區(qū)(rs4354668)的基因型頻率和等位基因頻率均無差異；中、重度疼痛帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人不同基因型間阿片類藥物用量無明顯差異；rs4354668位點基因多態(tài)性對帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人爆發(fā)痛的發(fā)生無明顯影響。中度和重度疼痛亞組病人的年齡比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.043)，已有研究表明PHN的患病率隨年齡增加而逐漸升高[13]，在70歲及以上者中PHN的患病率可達75%[14]。高齡病人免疫力下降，病毒損害神經(jīng)后難以自我修復(fù)，發(fā)生PHN的概率大，疼痛程度和持續(xù)時間也會增加。上述結(jié)果提示EAAT2基因rs4354668位點單核苷酸多態(tài)性對帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人疼痛敏感性無影響。

Lepore等的研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)頸髓損傷的大鼠的慢性熱痛覺過敏表現(xiàn)伴隨著背角神經(jīng)元和星形細胞的活化以及谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT-1的丟失，進一步的研究發(fā)現(xiàn)過度表達GLT-1，可以減輕熱痛覺過敏并減少頸脊髓損傷后的背角神經(jīng)元激活，表明通過調(diào)節(jié)GLT-1水平可以減輕神經(jīng)元過度興奮，緩解神經(jīng)病理性疼痛[15,16]。Shi等人的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠的痛覺過敏和痛覺超敏行為與谷氨酸的水平增加和脊髓中GLT-1表達水平減弱有關(guān)[8]。而Le等對慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷的大鼠研究卻并沒有發(fā)現(xiàn)疼痛行為與谷氨酸轉(zhuǎn)運體表達之間有特定的因果關(guān)系[17]。Shin等人通過對133名偏頭痛病人的研究發(fā)現(xiàn)，rs4354668位點不同基因型病人之間頭痛發(fā)作的頻率，疼痛強度和持續(xù)時間均沒有差異，但發(fā)現(xiàn)A等位基因的偏頭痛病人使用止痛藥的頻率明顯高于沒有A等位基因的偏頭痛病人(P= 0.019)，推測EEAT2基因多態(tài)性在鎮(zhèn)痛藥的過度使用中具有潛在的遺傳影響[18]。本實驗的研究對象是帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人，結(jié)果顯示并未發(fā)現(xiàn)EAAT2基因rs4354668位點基因多態(tài)性與疼痛敏感性有顯著的相關(guān)性，與上述實驗結(jié)果相一致。

本研究的不足之處：第一，本試驗未能檢測病人的GLT-1和血漿谷氨酸水平，同時病人的精神狀態(tài)，飲食，睡眠等也可能影響體內(nèi)激素水平，從而影響試驗結(jié)果。之前的研究表明，EAAT2基因多態(tài)性可影響GLT-1和血漿谷氨酸水平，而GLT-1和血漿谷氨酸水平與疼痛敏感性密切相關(guān)。第二，爆發(fā)痛是指在基礎(chǔ)疼痛控制相對穩(wěn)定和藥量充足的前提下，自發(fā)的、或由觸發(fā)因素引起的短暫疼痛加重[19]。目前對帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人爆發(fā)痛的研究不多，但臨床上很常見。本試驗納入了可能影響爆發(fā)痛發(fā)生的相關(guān)因素進行單因素分析，結(jié)果顯示無明顯差異。進一步行多因素Logistic回歸分析亦未示明顯差異。這可能與爆發(fā)痛組樣本量較少（24例）有關(guān)。第三，阿片類藥物的作用涉及多種復(fù)雜機制，已有研究表明COMT, OPRM1, ABCB1, GCH1等多個SNP位點可影響阿片類藥物的個體化應(yīng)用[20～22]，而本試驗中僅研究了單一的SNP位點。第四，除了本研究中的SNP位點以外，EAAT2基因仍可能存在其他與疼痛相關(guān)的SNP位點，本實驗并未納入考慮。第五，由于本研究入組的樣本量有限及存在性別、年齡、受累神經(jīng)節(jié)段及合并癥等干擾因素，仍需要進一步研究證實結(jié)果的可靠性。

綜上所述，在本試驗中EAAT2基因rs4354668位點基因多態(tài)性對帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的疼痛敏感性無明顯影響，其基因多態(tài)性可能不是帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人疼痛敏感性個體差異的機制。