采后硝普鈉處理對南果梨果實貯藏品質(zhì)和 細(xì)胞壁降解酶的影響

程 園，李燦嬰，侯佳寶，李 雪，王曉涵，葛永紅

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù) 國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

南果梨屬于薔薇科梨屬植物[1]，是遼寧省特色水果之一，其氣味芳香、爽口多汁、味道香甜、略帶酒香味道、營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛[2]。新鮮采摘的南果梨果皮呈綠黃色，果實脆而硬，并且風(fēng)味淡，常溫貯藏10～15 d果皮變金黃色，散發(fā)出特有的芳香氣味，達(dá)到最佳可食 度[3]。南果梨果實采后常溫貯藏時間短，很容易軟化、果肉褐變，從而導(dǎo)致品質(zhì)下降，甚至腐爛變質(zhì)，降低商品價值并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，開發(fā)綠色、安全、高效的保鮮技術(shù)是促進(jìn)南果梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵所在[4]。

果實貯藏期間的軟化主要是由細(xì)胞壁厚度、組成和細(xì)胞大小、形狀、內(nèi)容物等方面的變化造成的[5]。其中細(xì)胞壁的其他變化通常包括一些增溶作用、解聚和酸性果膠的去甲基酯化，以及大量多糖中糖側(cè)鏈的丟失[6]，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變和組織凝結(jié)力下降[7]。因此，影響果實軟化的機(jī)制之一是細(xì)胞壁物質(zhì)降解，而細(xì)胞壁降解酶活性升高是造成細(xì)胞壁物質(zhì)分解的主要因素，包括果膠酶類、纖維素酶和半纖維素酶[8]。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（polygalacturonic acid transeliminase，PGTE）、果膠甲基反式消除酶（pectin methyltranseliminase，PMTE）和纖維素酶（cellulase，Cx）是主要的細(xì)胞壁降解酶，在果實軟化中具有重要作用。

研究表明，采后1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）處理、高分子涂膜、氣調(diào)貯藏以及熱激處理等能夠保持梨果實的品質(zhì)，并延緩衰老進(jìn)程[9-12]。硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）即亞硝基鐵氰化鈉，進(jìn)入植物體后在半胱氨酸、谷胱甘肽或其他2SH類化合物或者細(xì)胞色素P2450/NADPH系統(tǒng)的催化下釋放出NO[13]。研究表明，NO不僅可以減少梨和荔枝果實質(zhì)量損失、顏色變化、病原菌侵染等[14-15]，而且還可通過抑制呼吸代謝來延緩果實的衰老[16-17]。目前，SNP已廣泛應(yīng)用于蒜苔、桃、菠菜、青花菜等果蔬的保鮮貯藏方面[18]。研究表明，SNP處理可以提高西蘭花中多種酶活性[19]，抑 制桃果實乙烯的產(chǎn)生[20]，有效降低香蕉皮的黃腐病和鮮質(zhì)量[21]。但有關(guān)SNP處理對南果梨果實貯藏品質(zhì)和細(xì)胞壁降解酶的影響還缺乏深入研究。

本研究以南果梨果實為材料，采后用SNP溶液進(jìn)行浸泡處理，研究其對果實常溫貯藏期間質(zhì)量損失率、呼吸強(qiáng)度、硬度等品質(zhì)指標(biāo)及細(xì)胞壁降解酶活力的影響，為南果梨果實的貯藏保鮮提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南果梨果實采自錦州市，在商業(yè)成熟度時采收，紙箱包裝后當(dāng)天運抵實驗室進(jìn)行處理。

SNP、氫氧化鈉 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、考馬斯亮藍(lán) 天津市福晨化學(xué)試劑廠；果膠、3,5-二硝基水楊酸、三羥甲基氨基甲烷 北京索萊寶科技有限公司；磷酸鈉（Na3PO4） 山東西亞化工有限公司；無水乙醇 天津市風(fēng)船科學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州） 有限公司；Centrifuge5424R小型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；WYT-32型阿貝折光儀 廈門中村光學(xué)儀器廠；GY-1型水果硬度計 杭州托普儀器有限公司；Check Point II型便攜式CO2分析儀 丹麥 PBI-Dansensor公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

選取大小均一、無機(jī)械傷和病蟲害的南果梨果實，用前期實驗篩選的0.25 mmol/L SNP（含0.01 mL/L Tween 20）溶液常溫浸泡果實10 min，以清水處理為對照。全部處理果實常溫晾干后裝箱，于20 ℃、相對濕度30%～40%條件下貯藏12 d，每隔2 d取樣進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3.2 可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用阿貝折光儀測定，在南果梨果實赤道部位陰陽面均勻取2 處皮下2～10 mm的果肉，每次測定用果實10 個。

1.3.3 呼吸強(qiáng)度測定

各處理組中分別取15 個果實，分別稱質(zhì)量后平均放入3 個自封袋中保存1 h，然后用Check Point II型便攜式CO2分析儀測定探針刺入密封袋中，測定CO2濃度，呼吸強(qiáng)度以每千克果實每小時釋放的CO2體積表示，單 位為mL/（kgg h）。

1.3.4 質(zhì)量損失率測定

測量果實貯藏前后的質(zhì)量，并用差量法（公 式（1））計算果實質(zhì)量損失率。每組處理用果實5 個，重復(fù)3 次。

1.3.5 果肉硬度測定

各組選取果實15 個，削去果實赤道部分陰陽面果皮，采用GY-1型硬度計測定硬度，單位為kg/cm2。

1.3.6 抗壞血酸含量測定

取樣參照范存斐等[22]方法并修改，取各組果實10 個，在果實赤道部位取皮下5～10 mm處果肉組織3.0 g。參照任亞琳[23]等方法測定抗壞血酸含量，在 265 nm波長處測定吸光度，抗壞血酸含量以鮮質(zhì)量計。

1.3.7 可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

取各組果實皮下5～10 mm處果肉組織3.0 g，參照陳松江等[24]的方法，采用NaOH滴定法測定可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式（2）計算。

式中：c為標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度/（mol/L）；V為滴定消耗NaOH溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；K為換算為蘋果酸的系數(shù)（0.067 g/mol）。

1.3.8 細(xì)胞壁降解酶的提取及活力測定

取各組果實皮下5～10 mm處果肉組織3.0 g進(jìn)行粗酶液提取。PG、PME、PGTE、PMTE的提取均參照楊志敏等[25]的方法。

PG和PME活力測定參照陳夕軍等[26]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸法在540 nm波長處測定反應(yīng)混合液釋放還原糖的量。PG、PME分別以每克組織每分鐘催化多聚半乳糖醛酸和果膠產(chǎn)生1 μg底物為一個酶活 力單位（U）。

PGTE和PMTE活力測定參照楊志敏等[25]的方法，在232 nm波長處測定反應(yīng)混合液的吸光度，根據(jù)PGTE分解多聚半乳糖醛酸以及PMTE分解果膠所釋放的不飽和醛酸量，分別計算PMTE和PGTE的活力。以30 ℃下每分鐘每克組織在酶促反應(yīng)下催化底物釋放1 μmol不飽和醛酸反應(yīng)量為一個酶活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

除硬度外，其他實驗均重復(fù)3 次。用Microsoft Excel 2007軟件計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，并作圖，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行最小顯著差法分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP處理對南果梨果實質(zhì)量損失率和呼吸強(qiáng)度的影響

圖 1 SNP處理對南果梨果實質(zhì)量損失率（A）和呼吸強(qiáng)度（B）的影響Fig. 1 Effect of SNP treatment on mass loss rate (A) and respiratory intensity (B) of Nanguo pears

由圖1A可以看出，隨著貯藏時間的延長，對照組和SNP處理組果實的質(zhì)量損失率逐漸上升，但SNP處理組果實的質(zhì)量損失率始終低于對照組，在貯藏第12天，對照組果實的質(zhì)量損失率是處理組的1.09 倍。由圖1B可知，南果梨果實在貯藏過程中出現(xiàn)明顯的呼吸躍變峰，對照組和SNP處理組果實呼吸強(qiáng)度呈先升高后降低趨勢，在第6和第8天差異顯著（P＜0.05），二者均在貯藏第8天出現(xiàn)呼吸高峰，但SNP處理明顯抑制了呼吸強(qiáng)度的變化，在貯藏第8天時對照組果實呼吸強(qiáng)度是SNP處理組果實的1.18 倍。

2.2 SNP處理對南果梨果肉硬度和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖 2 SNP處理對南果梨果實果肉硬度（A）和可溶性固形物 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）的影響Fig. 2 Effect of SNP treatment on flesh firmness (A) and total soluble solids content (B) of Nanguo pears

由圖2A可知，隨著貯藏時間的延長，對照組和SNP處理組果實果肉硬度逐漸下降，但SNP處理組果肉硬度高于對照，并且在貯藏第4～12天差異顯著 （P＜0.05），在貯藏第12天，SNP處理組的果肉硬度是對照組的1.49 倍。由圖2B可知，在整個貯藏期間，對照組和SNP處理組果實可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后降低，但SNP處理組果實的可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終高于對照，貯藏第8天時兩組可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最高，此時SNP處理組果實是對照組的1.04 倍。

2.3 SNP處理對南果梨果實可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗壞血酸含量的影響

由圖3A可知，隨著貯藏時間的延長，對照組和SNP處理組果實逐漸下降，但SNP處理組果實可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于對照組；在貯藏第12天，SNP處理果實可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對照組，是對照組的1.30 倍。由 圖3B可知，在整個貯藏期間，對照組和SNP處理組果實抗壞血酸含量整體呈下降趨勢；SNP處理組果實抗壞血酸含量在貯藏2～8 d有升高的趨勢，且整個貯藏過程中均高于對照組，在貯藏第8天，SNP處理組果實抗壞血酸含量是對照組的1.17 倍。

圖 3 SNP處理對南果梨果實可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）和 抗壞血酸含量（B）的影響Fig. 3 Effect of SNP treatment on titratable acid (A) and ascorbic acid (B) contents in Nanguo pears

2.4 SNP處理對南果梨果實PME和PG活力的影響

圖 4 SNP處理對南果梨果實PME（A）和PG（B）活力的影響Fig. 4 Effect of SNP on PME (A) and PG (B) activites in Nanguo pears

由圖4A可知，在整個貯藏期間，對照組和SNP處理組果實PME活力都先升高后降低，SNP處理組果實PME活力均低于對照組，在貯藏第8天時二者的差異最大，此時對照組果實PME活力是SNP處理組的1.25 倍。由 圖4B可知，對照組和SNP處理組果實PG活力都呈現(xiàn)先上升后降低趨勢，但SNP處理組果實PG活力總體顯著低于對照組，且均在第6天達(dá)到最大，此時對照組果實PG活力是SNP處理組的1.12 倍。

2.5 SNP處理對南果梨果實PGTE和PMTE活力的影響

圖 5 SNP處理對南果梨果實PGTE（A）和PMTE（B）活力的影響Fig. 5 Effect of SNP on PGTE (A) and PMTE (B) activites in Nanguo pears

由圖5A可知，對照組和SNP處理組果實PGTE活力貯藏前期呈上升趨勢，SNP處理抑制了PGTE活力變化；且兩組均在貯藏第10天時PGTE活力達(dá)到最大值，對照組果實PGTE活力是SNP處理組的1.04 倍。由圖5B可知，隨著貯藏時間的延長，對照組和SNP處理果實PMTE活力均先上升后降低，但對照組果實PMTE活力顯著高于SNP處理，二者均在第6天達(dá)到最大值，此時對照組果實PMTE活力是SNP處理組的1.13 倍。

3 討 論

果實呼吸強(qiáng)度、硬度、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗壞血酸含量等是評定果實貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)，這些指標(biāo)的變化與果實的成熟衰老密切相關(guān)，其中由細(xì)胞壁降解酶引起的果實軟化是硬度變化的主要原因。細(xì)胞壁的主要成分為果膠物質(zhì)、纖維素和半纖維素，在貯藏過程中，果膠物質(zhì)降解導(dǎo)致胞間層結(jié)構(gòu)變化，從而引起果實的軟化[27]。

果實采后仍進(jìn)行呼吸作用，消耗體內(nèi)的有機(jī)化合物供能。貯藏期間，淀粉水解并轉(zhuǎn)化為可溶性糖，造成可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加[28]，而呼吸作用除了消耗糖類物質(zhì)造成果實品質(zhì)的下降，還會使有機(jī)酸含量發(fā)生變化。本實驗發(fā)現(xiàn)，SNP處理能有效降低南果梨果實呼吸強(qiáng)度和質(zhì)量損失率，延緩南果梨果實可溶性固形物及可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降。有研究發(fā)現(xiàn)，SNP處理能夠延緩碭山酥梨[29]和柑橘[30]果實可滴定酸及可溶性固形物含量的降低，抑制火龍果[31]和枸杞[32]果實的呼吸強(qiáng)度，減少富士蘋果[33]的質(zhì)量損失。由此表明，采后SNP處理有利于保持不同果實的貯藏品質(zhì)，延長其貯藏期。

抗壞血酸是植物體內(nèi)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中重要的還原物質(zhì)，能有效清除活性氧，提高抗氧化能力，從而延緩果實的衰老過程。本實驗發(fā)現(xiàn)，采后SNP處理提高了南果梨果實抗壞血酸含量，延長了果實的貯藏時間。這與外源NO處理番茄植株[34]、茄子[35]等的實驗結(jié)果一致。

果實的硬度主要與水分蒸騰和果膠物質(zhì)降解有關(guān)。在后熟過程中，南果梨果實硬度逐漸下降，而與果實硬度相關(guān)的細(xì)胞壁降解酶活力也在相應(yīng)變化。主要表現(xiàn)為原果膠被細(xì)胞壁降解酶分解為可溶性的果膠，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，果實硬度下降開始軟化[36]。PG是細(xì)胞壁降解的關(guān)鍵酶，其主要功能是水解細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸生成低聚的半乳糖醛酸和半乳糖醛酸，而PME催化果膠分子鏈上半乳糖醛酸的甲酯化為PG準(zhǔn)備水解底物，在果膠物質(zhì)降解和果實軟化中起輔助作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，使果實軟化。在細(xì)胞壁降解酶中，PGTE和PMTE的活力較低，果膠裂解酶PGTE優(yōu)先裂解果膠酸分子中的α-1,4-糖苷鍵，而PMTE主要降解細(xì)胞壁中的果膠或甲基酯化的多聚半乳糖醛酸，對未甲基化的多聚半乳糖醛酸不起作用[37]。本研究發(fā)現(xiàn)SNP處理抑制了南果梨果實PG、PGTE、PME和PMTE活力的升高，從而抑制了其對細(xì)胞壁物質(zhì)的降解，有效延緩了南果梨果實的軟化。有研究發(fā)現(xiàn)，SNP處理可以降低馬鈴薯葉片水分蒸騰[38]；外源NO處理可延緩梨棗果實[28]、黃瓜[39]、雙孢蘑菇[40]等果實的硬度下降，抑制番茄[41]和蓮霧[42]果實中細(xì)胞壁降解酶的活力。這些結(jié)果表明，采后SNP處理能夠延緩果實硬度的下降，并且硬度的下降與SNP抑制細(xì)胞壁降解酶活力密切相關(guān)。

綜上所述，0.25 mmol/L SNP處理能有效降低南果梨果實質(zhì)量損失率以及呼吸強(qiáng)度，抑制果膠物質(zhì)降解酶活力，從而延緩果實軟化并保持果實貯藏品質(zhì)。