紫花蕓豆肽修復(fù)H2O2對HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷

馬 萍，程天賦，郭增旺，周 義，王 欣，曹冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

蕓豆學(xué)名菜豆，是豆科菜豆屬的小宗雜糧作物[1]，是栽培面積僅次于大豆的食用豆類作物之一[2]。紫花蕓豆是黑龍江省種植量最大的一個(gè)品種，其富含蛋白質(zhì)、多糖、花色苷、維生素等多種營養(yǎng)成分，還含有皂苷、尿毒酶等獨(dú)特成分，具有提高人體自身免疫能力、激活淋巴T細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展、促進(jìn)脫氧核苷酸合成等功能，是開發(fā)高檔食品及功能性食品的優(yōu)質(zhì)原料[3-5]。

當(dāng)機(jī)體受到外源性或內(nèi)源性氧化物質(zhì)損傷時(shí)，體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)遭到破壞，從而引起ROS在體內(nèi)堆積并產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[6]。自由基水平過高時(shí)會(huì)氧化細(xì)胞膜、代謝酶系、蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)，還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對機(jī)體的細(xì)胞及器官造成損傷[7-9]。 研究表明，自由基與衰老、炎癥、癌癥、心血管疾病等都有密切的關(guān)系[10-12]，因此，開發(fā)具有清除自由基的功能性食品和藥物日益受到重視?？寡趸氖侵妇哂锌寡趸δ艿纳锘钚噪?，由于具有分子質(zhì)量小、生物活性高、抗原性低、易吸收等特點(diǎn)而被廣泛研究[13-14]。大量研究表明，食源性蛋白酶解物如大米蛋白肽、小麥蛋白肽、大豆蛋白肽等具有抗氧化活性，能夠清除自由基[15-21]，但是對生物活性肽是如何通過調(diào)控凋亡蛋白通路進(jìn)行協(xié)作發(fā)揮抗氧化活性的研究還較少。本課題組前期制備了紫花蕓豆抗氧化肽，并通過體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)雙酶水解得到的紫花蕓豆肽（Phaseolus vulgarispeptides，PVPs）具有體外抗氧化活性[21]。為了系統(tǒng)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)PVPs的抗氧化活性及其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，采用水溶性四唑鹽法（WST-1法）檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測胞內(nèi)抗氧化物酶系活性，Western blot法檢測PVPs對細(xì)胞凋亡通路的影響，以此評(píng)價(jià)PVPs的抗氧化活性并探索其作用機(jī)理，從而為PVPs的功能性食品開發(fā)和抗氧化活性肽的作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆產(chǎn)地黑龍江省齊齊哈爾市依安縣，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.17%，由國家雜糧工程技術(shù)研究中心提供；紫花蕓豆蛋白由本實(shí)驗(yàn)室通過堿提酸沉法[22]制得， 純度92.2%。

人肝癌細(xì)胞HepG2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；DMEM高糖液體培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素 美國Hyclone公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶消化液 美國Gibco公司；1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）、RIPA細(xì)胞裂解液、丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、凝膠試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗p53單克隆抗體、兔抗Caspase-3單克隆抗體、鼠抗Caspase-3單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗 美國CST公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；多功能酶標(biāo)儀 上海三科儀器有限公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀 美國BD公司；EVOS熒光顯微鏡 美國Life Technologies公司；半干轉(zhuǎn)膜儀、電泳槽、ChemiDoc XRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；TS-2000A多用脫色搖床 海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PVPs的制備

PVPs參照課題組前期的研究方法[21]制備。工藝路線為：紫花蕓豆蛋白→加水（底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%）→熱處理（95 ℃、10 min）→冷卻→調(diào)至pH 10、50 ℃→加質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%胰蛋白酶→恒溫恒pH值水解4.5 h→滅酶（95 ℃、10 min）→冷卻→調(diào)至pH 9、60 ℃→加質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%堿性蛋白酶→恒溫恒pH值水解3 h→滅酶（95 ℃、10 min）→透析脫鹽12 h→冷凍干燥→PVPs

所得PVPs的純度為93.2%，分子質(zhì)量分布集中在6 kDa以下。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將HepG2細(xì)胞置于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM（高糖）培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%～90%后吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗 一次，加入1 mL胰蛋白酶消化3 min，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中培育4 h后更換培養(yǎng)基，除去未貼壁細(xì)胞并對其進(jìn)行分組[23]。正常對照組：不加PVPs和H2O2干預(yù)處理，只加入與實(shí)驗(yàn)組PVPs和H2O2相同體積的PBS；氧化應(yīng)激模型組：不加PVPs干預(yù)，加入與實(shí)驗(yàn)組PVPs相同體積的PBS溶液培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h；實(shí)驗(yàn)組：PVPs低劑量組（PVPs-L）、PVPs中劑量組（PVPs-M）、PVPs高劑量組（PVPs-H），采用終質(zhì)量濃度分別為50、100、200 μg/mL PVPs干預(yù)24 h后，加入終濃度為 2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h。

1.3.3 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖率的影響

參照臧琳等[24]的方法并略加改動(dòng)。采用WST-1法檢測細(xì)胞增殖率。選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，每孔體積100 μL，接種密度為2.0h 103個(gè)/mL， 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，每孔加入10 μL的WST-1溶液，混勻，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，振蕩充分混勻后，用酶標(biāo)儀以450 nm為檢測波長、630 nm為參考波長測定吸光度，按下式計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.3.4 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平的影響

參考Wang Wei等[25]的方法并略加改動(dòng)。選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個(gè)/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細(xì)胞后，每孔加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37 ℃避光反應(yīng)20 min后吸去探針，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2 次，隨后采用胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，離心除去上清液，PBS重懸細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞儀測定活細(xì)胞的ROS含量。

1.3.5 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MDA水平的影響

參考劉艷等[26]的方法，并略加改動(dòng)。選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個(gè)/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細(xì)胞后，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液使細(xì)胞裂解，于4 ℃、1 600hg下離心10 min，取上清液作為樣本，參照MDA測定試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書對細(xì)胞內(nèi)的MDA和蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定。

1.3.6 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胞內(nèi)抗氧化物酶系活力的影響

參照臧琳等[24]的方法并略加改動(dòng)。選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個(gè)/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細(xì)胞后，用預(yù)冷PBS洗滌1 次，棄去PBS，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，離心棄上清液，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃，12 000hg離心10 min。取上清液按照試劑盒說明書檢測SOD、GSH-Px及過氧化氫酶（catalase，CAT）活力，余下部分采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。

1.3.7 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)量的影響

參照Han等的方法[27]并略加改動(dòng)。選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個(gè)/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細(xì)胞后，加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，恒壓50、80、120 V電泳各30 min，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，暗室中加發(fā)光染料底物混合物1 mL于膜上顯色1 min，曝光顯影，結(jié)果采用Image Lab軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，組間比較采用Tukey法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞存活率的影響

圖 1 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的抑制作用Fig. 1 Effect of PVPs on viability of HepG2 cells induced by H2O2

由圖1 可知，H2O2誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞存活率僅為（6 5.2 4 f 3.0 1）%，與正常組相比顯著下降 （P＜0.05），這表明H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建的氧化應(yīng)激模型成功；與模型組相比，PVPs中、高劑量組可以顯著提高H2O2構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的細(xì)胞存活率（P＜0.05），顯著緩解H2O2引起HepG2細(xì)胞的增殖抑制，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。H2O2是構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的重要刺激原之一，能直接氧化細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，還能自由穿透細(xì)胞膜，與胞內(nèi)鐵離子結(jié)合反應(yīng)生成羥自由基等自由基，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并造成組織損傷[28]。模型組中的H2O2對HepG2細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了顯著的抑制作用，但中、高劑量的PVPs培養(yǎng)HepG2細(xì)胞后顯著降低了H2O2對細(xì)胞存活率的抑制作用。這表明PVPs能在一定程度上對HepG2細(xì)胞起到保護(hù)作用，能緩解H2O2對HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

2.2 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量的影響

圖 2 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量的影響Fig. 2 Effect of PVPs on ROS level in H2O2-induced HepG2 cells

當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞中的線粒體能通過呼吸爆發(fā)機(jī)制產(chǎn)生少量的ROS，促進(jìn)其發(fā)揮吞噬和酶解的生理功能[29-30]。但在病理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)的ROS升高到一定水平且氧化應(yīng)激機(jī)制不足以調(diào)控其回歸到正常水平時(shí)，將對細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)、生物膜造成氧化損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡[31]。在HepG2細(xì)胞處理后裝載ROS探針DCFH-DA，并使用流式細(xì)胞儀對胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測，ROS可以氧化胞內(nèi)無熒光的DCFH轉(zhuǎn)變成熒光DCF。因此，通常以正常細(xì)胞作為內(nèi)參，以發(fā)生熒光信號(hào)強(qiáng)度改變的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值表征細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，偏移量越大代表熒光強(qiáng)度越高，比例越高代表ROS水平越高。由圖2可知，與正常組相比，模型組的ROS含量顯著升高（P＜0.05）；低、中、高劑量的PVPs顯著降低了胞內(nèi)ROS含量（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。這表明PVPs可以減輕H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量的升高，從而發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的功能，減輕ROS對細(xì)胞和機(jī)體引發(fā)的氧化損傷。

2.3 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MDA水平的影響

圖 3 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MDA濃度的影響Fig. 3 Effect of PVPs on MDA concentration in HepG2 cells induced by H2O2

MDA是生物體內(nèi)的脂質(zhì)物質(zhì)受到自由基氧化而生成的最終氧化產(chǎn)物。ROS極易氧化細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，形成脂質(zhì)自由基，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生損傷，引起MDA水平升高，因此MDA水平直接反映了細(xì)胞膜受到自由基氧化損傷的嚴(yán)重程度[32]。由圖3可知，H2O2誘導(dǎo)的模型組MDA水平與正常組相比顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量的PVPs均顯著抑制H2O2引起的氧化應(yīng)激模型細(xì)胞MDA濃度的上升（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。模型組MDA水平顯著升高表明其細(xì)胞受到ROS刺激后，細(xì)胞膜發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷；而PVPs能顯著降低細(xì)胞的MDA水平，表明PVPs能對抗ROS引發(fā)的脂質(zhì)氧化作用，具有減輕自由基對機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的活性。

2.4 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞抗氧化物酶系活力的影響

圖 4 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞抗氧化物酶系活力的影響Fig. 4 Effect of PVPs on antioxidant enzyme activity in HepG2 cells induced by H2O2

SOD、CAT和GSH-Px均為細(xì)胞抗氧化物酶系中的重要組成部分，在機(jī)體發(fā)揮抗氧化和維護(hù)氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用[33-34]。SOD能催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)從而發(fā)揮清除自由基的作用；CAT約占CAT體系總量的40%，能催化H2O2生成水和氧氣，是CAT體系的標(biāo)志性酶；GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，其組成部分中的硒能催化GSH與過氧化物反應(yīng)，生成無毒的羥基化合物和氧化型谷胱甘肽，促使對機(jī)體和細(xì)胞有毒有害的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞和機(jī)體免受過氧化物的損傷；機(jī)體內(nèi)的抗氧化物酶系活力直接反映了細(xì)胞在氧化應(yīng)激環(huán)境下的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)能力[35-37]。由圖4可知，H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的抗氧化物酶系活力與正常組相比均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，PVPs低、中、高劑量組的SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。這表明此濃度的H2O2破壞了細(xì)胞的氧化調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞自身的抗氧化代謝調(diào)控能力不足以應(yīng)付外界刺激，細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷[33]；而在PVPs培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的抗氧化物酶系活力均顯著提高，表明PVPs能減輕H2O2對細(xì)胞抗氧化物酶系的破壞作用，減輕氧化應(yīng)激損傷并提高對外界氧化應(yīng)激的調(diào)控能力，這也和之前PVPs能減輕H2O2對細(xì)胞膜損傷的結(jié)果相一致。

2.5 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的影響

圖 5 PVPs對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞Caspase-3、p53蛋白表達(dá)量的影響Fig. 5 Effect of PVPs on the protein expression of caspase-3 and p53 in H2O2-induced HepG2 cells

p53蛋白又稱凋亡蛋白，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞基因組的完成性、DNA損傷的修復(fù)和細(xì)胞周期的運(yùn)行，主要介導(dǎo)DNA損傷后的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[38]。正常細(xì)胞內(nèi)的p53蛋白含量較低，當(dāng)由于外界環(huán)境造成核內(nèi)DNA損傷時(shí)胞內(nèi)p53表達(dá)量上升，調(diào)控細(xì)胞分裂周期停止于G1期，自我修復(fù)發(fā)生損傷的基因，若修復(fù)失敗則與其他凋亡基因協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[39-40]。Caspases通路在所有細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)都會(huì)被激活，而Caspase-3是細(xì)胞發(fā)生凋亡的最終執(zhí)行者。正常細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3蛋白處于非激活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3蛋白被激活轉(zhuǎn)化裂解產(chǎn)生能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性片段，后者能進(jìn)入核內(nèi)激活核酸內(nèi)切酶，從而使DNA發(fā)生裂解，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[41-42]。由圖5可知，與正常組相比，模型組胞內(nèi)Caspase-3和p53表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，PVPs低、中、高劑量組的Caspase-3和p53蛋白表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此濃度的H2O2誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，而PVPs能抑制胞內(nèi)凋亡蛋白的表達(dá)，并且與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，這和PVPs能顯著緩解H2O2引起HepG2細(xì)胞增殖抑制的作用結(jié)果相一致。

3 討 論

機(jī)體生長代謝過程中產(chǎn)生的自由基具有多種生理功能，如預(yù)防感染、激活細(xì)胞、信號(hào)傳導(dǎo)等。但是過多的自由基能導(dǎo)致機(jī)體正常的細(xì)胞組織發(fā)生病變并引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)損傷、DNA突變、細(xì)胞膜磷脂層氧化及低密度脂蛋白變性等損傷[43-44]，并促進(jìn)癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等疾病的病理學(xué)發(fā)展[45-47]。自由基衰老學(xué)說提出，機(jī)體的衰老是自由基在細(xì)胞內(nèi)逐漸積累并引起過度氧化損傷而導(dǎo)致的。大量研究表明，通過膳食補(bǔ)充抗氧化成分能夠增強(qiáng)機(jī)體的防御能力，幫助維持機(jī)體的氧化動(dòng)態(tài)平衡。蛋白質(zhì)是食物的重要組成部分，其水解產(chǎn)物具有特殊的生理功能，如大豆蛋白、雞蛋蛋白、花生蛋白、綠豆蛋白等均具有極強(qiáng)的抗氧化能力。PVPs是采用雙酶水解技術(shù)從紫花蕓豆蛋白中提取得到的水溶性活性多肽，前期研究結(jié)果表明，PVPs具有體外抗氧化活性，但是體內(nèi)抗氧化活性及其作用機(jī)制還尚未可知[21,48]。本實(shí)驗(yàn)為了深入研究開發(fā)紫花蕓豆抗氧化生物活性肽，進(jìn)一步探討了PVPs對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的細(xì)胞存活率和抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響。H2O2是一種重要的ROS，性質(zhì)相對穩(wěn)定，常作為體外氧化應(yīng)激損傷的造模藥物。因此，本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞作為研究對象、H2O2為造模藥物誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激損傷模型，通過細(xì)胞存活率、ROS水平、抗氧化物酶系活力及凋亡蛋白表達(dá)進(jìn)行探討，分析PVPs的抗氧化活性及其作用機(jī)制。

細(xì)胞存活率是表征細(xì)胞狀態(tài)的基礎(chǔ)指標(biāo)，直接反映外界刺激對細(xì)胞的損傷程度。高濃度ROS能直接損傷HepG2細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[39]。由細(xì)胞存活率和免疫印跡實(shí)驗(yàn)可知，H2O2誘導(dǎo)能對細(xì)胞造成損傷并使其存活率顯著下降，并且能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白p53和Caspase-3表達(dá)量的顯著升高。p53蛋白的生理學(xué)作用是當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，其表達(dá)量升高，調(diào)控細(xì)胞進(jìn)行自我基因修復(fù)，當(dāng)損傷不可逆時(shí)則協(xié)同其他凋亡蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而Caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者[48-49]。 這表明H2O2能顯著降低細(xì)胞存活率，引起胞內(nèi)DNA的損傷，從而造成p53表達(dá)量的升高，并與Caspase-3蛋白發(fā)生協(xié)同作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而PVPs處理HepG2細(xì)胞顯著降低了H2O2對其存活率的抑制作用，并且顯著降低了胞內(nèi)p53和Caspase-3蛋白的表達(dá)量。這表明PVPs能在一定程度上對HepG2細(xì)胞起到保護(hù)作用，能通過抑制其凋亡基因的表達(dá)和減輕ROS對胞內(nèi)DNA的損傷，從而緩解H2O2對HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

機(jī)體存在天然的抗氧化系統(tǒng)，一定程度內(nèi)的氧化應(yīng)激刺激能被自身機(jī)體的抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)所補(bǔ)償，因而不會(huì)引起機(jī)體的損傷，但當(dāng)外界氧化應(yīng)激源的刺激較為強(qiáng)烈并超出自身調(diào)節(jié)范圍時(shí)，細(xì)胞和組織就會(huì)受到氧化應(yīng)激損傷[33]。MDA是細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸被氧化時(shí)所生成的重要代謝產(chǎn)物，可作為脂質(zhì)過氧化程度的測定標(biāo)準(zhǔn)，其水平的高低可間接反映出細(xì)胞受自由基損傷的程度。由圖3可知，該濃度下的H2O2顯著提高了細(xì)胞的MDA水平，表明HepG2細(xì)胞受到了氧化應(yīng)激損傷。而PVPs處理HepG2細(xì)胞顯著降低了H2O2所引起的MDA濃度升高，表明PVPs能夠幫助細(xì)胞抵御自由基對其的脂質(zhì)氧化作用。機(jī)體內(nèi)存在兩類抗氧化系統(tǒng)能夠調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，即酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)[25]。內(nèi)源性抗氧化物酶SOD、CAT是防止氧化應(yīng)激產(chǎn)生的第一道防線。由圖4可知，H2O2對HepG2細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物酶系具有滅活的作用，當(dāng)HepG2細(xì)胞受到ROS刺激時(shí)會(huì)造成整個(gè)抗氧化防御系統(tǒng)遭到重創(chuàng)，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物酶系SOD、CAT和GSH-Px活力顯著降低，并且MDA水平顯著升高，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。而PVPs預(yù)培養(yǎng)能顯著上調(diào)抗氧化酶活力并降低MDA水平，恢復(fù)H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，這也可能是PVPs發(fā)揮抗氧化活性的作用機(jī)制。

H2O2能對HepG2細(xì)胞造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷。當(dāng)HepG2細(xì)胞遭受ROS刺激后，細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)并生成代謝產(chǎn)物MDA，膜通透性增強(qiáng)，并且對胞內(nèi)遺傳物質(zhì)造成破壞，引起p53和Caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)量升高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷并誘導(dǎo)其凋亡；為了抵抗外界ROS的刺激和恢復(fù)胞內(nèi)氧化還原平衡，內(nèi)源性的抗氧化物酶系（SOD、CAT和GSH-Px）被大量消耗，最終導(dǎo)致氧化防御系統(tǒng)紊亂。因此，當(dāng)HepG2細(xì)胞受到H2O2刺激后，細(xì)胞存活率顯著下降、凋亡通路被激活、MDA和抗氧化物酶系水平顯著改變。而本研究結(jié)果顯示，PVPs能顯著提高HepG2細(xì)胞的存活率，降低MDA和胞內(nèi)ROS水平，提高抗氧化物酶活力，降低凋亡蛋白的表達(dá)。這表明PVPs能通過降低胞內(nèi)ROS水平、提高過氧化酶系和抑制凋亡通路的激活緩解氧化應(yīng)激損傷。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了PVPs對H2O2所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷模型的細(xì)胞存活率、ROS水平、MDA水平、抗氧化物酶系活力和p53、Caspase-3蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：PVPs能緩解H2O2所引起的HepG2細(xì)胞存活率降低，并降低胞內(nèi)ROS、MDA水平，提高抗氧化物酶系中SOD、CAT、GSH-Px活力，并且下調(diào)p53、Caspase-3的蛋白表達(dá)量。PVPs對H2O2引起的HepG2細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，能通過提高細(xì)胞存活率、降低胞內(nèi)的ROS水平、減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化程度、抑制凋亡蛋白的表達(dá)和提高胞內(nèi)抗氧化物酶系的活力，提高機(jī)體的抗氧化能力，從而增強(qiáng)對外界氧化應(yīng)激的調(diào)控。