谷物蛋白體外消化率測(cè)定方法的修正

劉艷美，周學(xué)永,，付榮霞，Angadi Honnursab RAJASAB，肖建中

（1.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.古爾伯加大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，印度 古爾伯加 585308；3.天津市黑馬工貿(mào)有限公司，天津 301711）

谷物蛋白消化率是指在一定條件下，蛋白質(zhì)被蛋白酶水解為肽類(lèi)及氨基酸等可溶性物質(zhì)氮含量占谷物蛋白總氮量的比例[1-3]，也有文獻(xiàn)將其理解為可溶性蛋白質(zhì)量占物料蛋白總質(zhì)量的比例[4-5]。蛋白質(zhì)消化率的傳統(tǒng)測(cè)定采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行[6]，雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但評(píng)價(jià)過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且成本較高。谷物蛋白消化率的體外測(cè)定具有速度快、成本低的優(yōu)勢(shì)，因此受到了國(guó)內(nèi)外的廣泛重視，并取得重要進(jìn)展。目前胃-胰蛋白酶兩步體外消化法已成為測(cè)定谷物蛋白體外消化率的主要方法[6-10]，其原理是將谷物蛋白進(jìn)行酶解，然后過(guò)濾得到未被酶解的殘留蛋白，利用谷物粗蛋白總量扣除未被酶解的殘留蛋白量，即可計(jì)算谷物蛋白的體外消化率。

然而筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)谷物蛋白體外消化率的測(cè)定方法，在操作步驟上存在一定的差異，對(duì)于蛋白沉淀劑三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）的使用描述不一致，甚至出現(xiàn)了相互矛盾的測(cè)定步驟，這可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生重要影響。例如， 黃滄海[2]、張麗英[5]、王衛(wèi)國(guó)[11]等將飼料酶解后直接抽濾，濾渣烘干后用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量，然后利用飼料總蛋白含量扣除酶解后的殘留蛋白含量，計(jì)算得出樣品的蛋白消化率；而朱逸欣等[12]在飼料酶解液過(guò)濾前，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的TCA沉淀溶液中的蛋白質(zhì)，然后過(guò)濾沉淀，利用凱氏定氮法測(cè)定濾渣中殘留蛋白含量，計(jì)算蛋白消化率。唐茂妍[13]、梁明[14]和武建堂[15]等則在酶解液過(guò)濾前，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的磺基水楊酸以沉淀蛋白質(zhì)，余下步驟與前述相同并計(jì)算蛋白消化率。

綜合分析上述測(cè)定方法可知，酶解液在過(guò)濾前是否加TCA或磺基水楊酸以沉淀蛋白質(zhì)，已成為上述兩類(lèi)操作方法的主要區(qū)別。筆者認(rèn)為，由于谷物酶解液除了含有谷物蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物外，還含有酶解時(shí)加入的胃蛋白酶和胰蛋白酶，因此，TCA、磺基水楊酸這些蛋白沉淀劑的加入勢(shì)必會(huì)引起胃-胰蛋白酶的沉淀，這將影響過(guò)濾殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量，進(jìn)而影響蛋白體外消化率的測(cè)定結(jié)果。

為了規(guī)范谷物蛋白質(zhì)體外消化率的測(cè)定方法，本研究選取大米、小米、玉米和藜麥[16-17]4 種谷物，采用胃蛋白酶-胰酶兩步法測(cè)定其蛋白質(zhì)消化率，并在酶解液過(guò)濾前分別進(jìn)行加TCA與不加TCA的對(duì)比實(shí)驗(yàn)操作，通過(guò)比較這兩種操作方法對(duì)蛋白消化率測(cè)定結(jié)果的影響程度，最終確定合理的實(shí)驗(yàn)操作步驟。本研究對(duì)規(guī)范谷物蛋白消化率的實(shí)驗(yàn)操作具有參考意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥由山西華青藜麥生物科技有限公司提供；大米由天津市寶坻區(qū)歡喜稻蟹養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社提供；小米（‘晉谷21’）和玉米（‘中地88’）由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供。胃蛋白酶（10 000 IU/g）和胰蛋白酶（30 000 IU/g）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。鹽酸、氫氧化鈉、TCA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YB-250型高速多功能粉碎機(jī) 永康市速峰工貿(mào)有限公司；HNY-200D型恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；H2050R型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；UDK 159型全自動(dòng)凱氏定氮儀 意大利VELP公司；MAPADA型紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 4 種谷物總蛋白含量的測(cè)定

將谷物粉碎，按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定蛋白含量。

1.3.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶溶液的配制

準(zhǔn)確移取6.1 mL濃鹽酸，加蒸餾水稀釋到1 000 mL。將上述稀鹽酸加熱升溫到42～45 ℃，取下，加入20 g活力為10 000 IU/g的生化級(jí)胃蛋白酶。輕輕搖動(dòng)使其溶解，得到胃蛋白酶質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液，酶活力為200 IU/mL。

準(zhǔn)確稱(chēng)取3.521 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4g 2H2O），溶于100 mL蒸餾水，得到濃度為0.2 mol/L的磷酸二氫鈉溶液；準(zhǔn)確稱(chēng)取7.164 g磷酸氫二鈉（Na2HPO4g 12H2O），溶于100 mL蒸餾水，得到濃度為0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液。

準(zhǔn)確移取5.3 mL 0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液和94.7 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液，配制成100 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液（p H 8.0），將上述溶液加熱升溫到4 2 ～4 5 ℃，加入0.5 g 活力為3 0 0 0 0 I U/g 的生化級(jí)胰蛋白酶。輕輕搖動(dòng)使其溶解，得到胰蛋白酶質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，酶活力為150 IU/mL。

1.3.3 谷物蛋白體外消化率的測(cè)定（加TCA）

采用胃-胰蛋白酶兩步消化法測(cè)定4 種谷物蛋白質(zhì)體外消化率[18-19]，具體操作如下：稱(chēng)取1.0 g谷物（精確至0.000 1 g）于100 mL離心管中，加入pH 2.0的胃蛋白酶溶液（20 mg/mL）10 mL，將離心管置于（37f 1）℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中，振搖速率190 r/min。3 h后取下，添加0.5 mol/L NaOH溶液2.0 mL和pH 8.0的胰蛋白酶溶液（5 mg/mL）30 mL，混合液于37 ℃繼續(xù)振搖2 h。取出離心管，立即加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA 10 mL，搖勻后靜置1 h以沉淀未降解成氨基酸和小分子肽的可溶性蛋白質(zhì)。在4 ℃下離心（11 000 r/min、20 min），去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌、離心，重復(fù)兩次。取沉淀，于60 ℃烘箱烘干，采用凱氏定氮法測(cè)定沉淀物的蛋白含量，按公式（1）計(jì)算體外消化率。

1.3.4 谷物蛋白體外消化率的測(cè)定（不加TCA）

除不加TCA沉淀蛋白外，其他操作步驟同1.3.3節(jié)。

1.3.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定精確稱(chēng)取0.2 g胃蛋白酶或胰蛋白酶，按照GB 5009.5—2016 測(cè)定胃蛋白酶或胰蛋白酶中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.3.6 TCA對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶沉淀的影響

1.3.6.1 胃蛋白酶與胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以水為參照，將胃蛋白酶和胰蛋白酶分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的水溶液，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，利用吸光度與蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.2 TCA加入量對(duì)蛋白酶溶液沉淀效果的影響

按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA溶液與胃蛋白酶或胰蛋白酶溶液體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1混合后，室溫沉淀1 h，離心（11 000 r/min、10 min），取上清液在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。根據(jù)蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中未沉降的蛋白酶質(zhì)量濃度。以蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以TCA溶液與蛋白酶溶液之間的體積比為橫坐標(biāo)，繪制蛋白酶沉降曲線。按式（2）計(jì)算蛋白沉降率。

1.3.6.3 胃-胰蛋白酶沉淀物中蛋白背景值的測(cè)定

不加谷物樣品，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行操作，胃-胰蛋白混合酶溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA溶液10 mL后靜置、抽濾，測(cè)定沉淀中蛋白質(zhì)量。按式（3）計(jì)算蛋白干擾率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，若差異達(dá)到顯著 （P＜0.05），則進(jìn)行Duncan’s法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白含量

胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表 1 胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白含量Table 1 Protein contents in pepsin and trypsin

由表1可看出，胃蛋白酶中蛋白含量為7.67 g/100 g，胰蛋白酶中蛋白含量為8.47 g/100 g。在谷物酶解液中，胃蛋白酶加入量為200 mg，其中蛋白質(zhì)量為15.34 mg；胰蛋白酶加入量為150 mg，其中蛋白質(zhì)量為12.71 mg，兩種酶中蛋白總質(zhì)量為28.05 mg。在消化率的測(cè)定過(guò)程中，谷物用量為1 000 mg，因此，如果胃-胰 蛋白酶能夠全部被TCA沉淀，則將導(dǎo)致谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果偏高2.80%。

2.2 TCA對(duì)胃蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 0% T C A 與胃蛋白酶溶液（酶液初始質(zhì)量濃度4.76 mg/mL，其中蛋白質(zhì)量濃度為 4.76 mg/mLh 7.67%＝0.365 mg/mL）分別按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的體積比混合后，室溫沉淀1 h，離心（11 000 r/min、10 min），取上清液測(cè)蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 TCA加入量對(duì)胃蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度影響Fig. 1 Effect of TCA on protein concentration in pepsin solution

由圖1 可見(jiàn)，胃蛋白酶中蛋白質(zhì)初質(zhì)量濃度為0.365 mg/mL，隨著TCA溶液加入體積的增加，酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度逐漸減小。當(dāng)TCA溶液與胃蛋白酶溶液體積比為4∶1時(shí)，酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度基本保持不變。根據(jù)胃蛋白酶沉降曲線，最終確定TCA溶液與胃蛋白酶溶液體積比為4∶1，即可達(dá)到最佳的蛋白沉淀效果。

不過(guò)從圖1可以看出，胃蛋白酶沉淀并不完全，當(dāng)TCA與胃蛋白酶溶液體積比在1∶1～5∶1之間變化時(shí)，胃蛋白酶的沉降率為39.28%～58.92%。以最高的沉降率計(jì)算，胃蛋白酶（用量200 mg）在測(cè)定過(guò)程中對(duì)谷物沉淀蛋白含量的干擾率為0.9%。

2.3 TCA對(duì)胰蛋白酶濾液中蛋白質(zhì)濃度的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA與胰蛋白酶溶液（酶液初始質(zhì)量濃度3.57 mg/mL，其中蛋白質(zhì)量濃度為3.57 mg/mLh 8.47%＝0.302 mg/mL）分別按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的體積比混合后，室溫沉淀1 h。離心（11 000 r/min、10 min），取上清液測(cè)蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 TCA加入量對(duì)胰蛋白酶溶液中蛋白濃度影響Fig. 2 Effect of TCA on protein concentration in trypsin solution

由圖2 可見(jiàn)，胰蛋白酶中蛋白初始質(zhì)量濃度為0.302 mg/mL，隨TCA溶液體積的增加，胰蛋白酶中蛋白質(zhì)量濃度有明顯下降趨勢(shì)。當(dāng)TCA溶液與胰蛋白酶溶液之比為4∶1時(shí)，胰蛋白酶中蛋白濃度已基本不再變化。根據(jù)胰蛋白酶沉降曲線，確定V（TCA）∶V（胰蛋白酶溶液）為4∶1即可達(dá)到最佳的蛋白沉淀效果。當(dāng)V（TCA）∶V（胰蛋白酶溶液）在1∶1～5∶1之間變化時(shí)，胰蛋白酶的沉降率為50.33%～80.13%。以最高的沉降率計(jì)算，胰蛋白酶（用量150 mg）在測(cè)定過(guò)程中對(duì)沉淀蛋白含量的干擾率為1.02%。

對(duì)比圖1與圖2可知，TCA溶液對(duì)胰蛋白酶的沉降效果優(yōu)于胃蛋白酶。沉淀效果的差異可能與二者的等電點(diǎn)有關(guān)。胰蛋白酶的等電點(diǎn)pI為10.8[20]，而胃蛋白酶具有極低的等電點(diǎn)（如豬胃蛋白為pH 1.0）[21]。在相同的酸性沉淀?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)越高，其所帶正電荷的數(shù)量越多，就越容易與帶負(fù)電荷的TCA形成沉淀。

2.4 TCA對(duì)谷物蛋白體外消化率測(cè)定的影響

谷物蛋白酶溶液在過(guò)濾前采取加入TCA與不加入TCA兩種操作，過(guò)濾得到的沉淀中蛋白含量差異見(jiàn)表2。

表 2 TCA對(duì)酶解過(guò)濾沉淀中蛋白含量的影響Table 2 Effect of TCA on protein content in precipitates from hydrolysate filtration

由表2可知，谷物蛋白酶解液在過(guò)濾前采取加入TCA后，沉淀中蛋白質(zhì)含量明顯增加，除了大米之外，均有顯著性差異（P＜0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，谷物粗蛋白質(zhì)含量越高，TCA對(duì)沉淀蛋白含量的增加效果就越明顯。胃-胰蛋白酶的沉淀不是導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果升高的唯一原因。結(jié)合前述2.1～2.3節(jié)的研究結(jié)果可知，胃-胰蛋白酶沉淀對(duì)谷物蛋白含量的影響不會(huì)超過(guò)1.92%（胃蛋白酶0.9%，胰蛋白酶1.02%），而TCA對(duì)小米和藜麥沉淀蛋白含量的影響均超過(guò)了2%。因此可以認(rèn)為，除了蛋白酶之外，可溶性谷物蛋白也發(fā)生了沉淀，且谷物蛋白初始含量越高，沉淀現(xiàn)象就越明顯。

在表2數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上對(duì)谷物蛋白體外消化率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果列于表3。

表 3 TCA加入對(duì)谷物蛋白體外消化率的影響Table 3 Effect of TCA on the in vitro digestibility of cereal protein

根據(jù)蛋白體外消化率計(jì)算公式，谷物酶解后的沉淀中殘留蛋白含量越高，蛋白消化率的計(jì)算結(jié)果就越低，也就是說(shuō)，TCA的加入對(duì)沉淀蛋白含量的影響及其對(duì)消化率的影響恰好呈相反趨勢(shì)。由表3可知，谷物蛋白酶解液如果采取不加TCA而直接過(guò)濾的操作方式，蛋白消化率測(cè)定結(jié)果將明顯偏高（P＝0.002＜0.01），其中大米、玉米、小米、藜麥4 種谷物蛋白的體外消化率分別提高了2.85%、3.42%、15.97%和18.74%，酶解液過(guò)濾前添加TCA能夠糾正結(jié)果偏高現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn)，谷物蛋白初始含量越高，TCA對(duì)其蛋白消化率的影響就越大。造成這種現(xiàn)象的原因推測(cè)有兩個(gè)：一是酶解液中存在未被胃-胰蛋白酶降解成小分子肽及氨基酸的可溶性蛋白質(zhì)，TCA的加入促使這些蛋白進(jìn)入沉淀中，導(dǎo)致消化率計(jì)算結(jié)果降低；二是酶解液中谷物蛋白、胃蛋白酶和胰蛋白酶在TCA的作用下發(fā)生共沉淀，引起消化率測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步降低?？梢赃@樣認(rèn)為，加入TCA使谷物中可溶性蛋白形成沉淀屬于正常糾偏，而使胃-胰蛋白酶發(fā)生沉淀則屬于過(guò)度糾偏。

一般而言，谷物蛋白在酶解過(guò)程中首先是溶解，其次是降解。因此，谷物中粗蛋白含量越高，酶解一定時(shí)間后其所含有的可溶性蛋白含量就越高，相應(yīng)地被TCA所沉淀的蛋白數(shù)量就越多，消化率測(cè)定結(jié)果的下降程度也就越大。就蛋白的共沉淀而言，有研究認(rèn)為，植物蛋白在采取等電點(diǎn)沉淀、酸-熱沉淀等提取過(guò)程中，可以與蛋類(lèi)蛋白、血蛋白、酵母蛋白形成共沉淀，最終得到多種蛋白的混合物[22-24]。在本研究中，谷物蛋白含量越高，酶解液中就蛋白質(zhì)量濃度就越大，加入TCA時(shí)蛋白沉降現(xiàn)象就越明顯。在這種情況下，谷物蛋白會(huì)對(duì)酶蛋白形成包裹而一同沉淀。在共沉淀過(guò)程中，相同濃度的TCA會(huì)導(dǎo)致更多的胃-胰蛋白酶發(fā)生沉淀，對(duì)結(jié)果的干擾程度增大。因此，谷物蛋白與胃-胰蛋白酶形成共沉淀是一個(gè)不容忽視的因素。

2.5 TCA法測(cè)定谷物蛋白體外消化率的公式修正

通過(guò)上述分析可知，在酶解法測(cè)定谷物蛋白消化率的過(guò)程中，不加TCA會(huì)引起測(cè)定結(jié)果偏高，而加入TCA又會(huì)同時(shí)引起谷物可溶性蛋白和酶的一同沉淀，最終導(dǎo)致結(jié)果偏低。因此，該測(cè)定方法必須加以修正，需要合理扣除胃-胰蛋白酶沉淀所造成的影響。本研究提出了修正公式（式（4））。

式中：NT為蛋白樣品總的粗蛋白含量/（g/100 g）；Nf為樣品消化結(jié)束時(shí)加入T C A 后沉淀中蛋白含 量/（g/100 g）；Ne為胃-胰蛋白酶混合液與TCA形成沉淀中的蛋白含量/（g/100 g）。

4 種谷物采用修正公式得到的蛋白消化率結(jié)果列于表4。由表4可以看出，修正后谷物蛋白消化率測(cè)定數(shù)值均較修正前有所升高，提高幅度在1.78%～3.39%之間。因此，在谷物蛋白體外消化率的測(cè)定中，不扣除胃-胰蛋白酶空白對(duì)照值將導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。

表 4 修正前后4 種谷物蛋白消化率的比較（TCA法）Table 4 Comparison of protein digestibility of four kinds of grains before and after modification (TCA method)

3 討 論

3.1 蛋白體外消化率的概念有待進(jìn)一步明確

蛋白質(zhì)體外消化率測(cè)定方法不統(tǒng)一，源于對(duì)蛋白質(zhì)體外消化率概念認(rèn)識(shí)上的差異。比如有文獻(xiàn)認(rèn)為， 蛋白質(zhì)的消化率是指可溶性蛋白質(zhì)占物料總蛋白質(zhì)的比例[4-5,25]；但也有文獻(xiàn)認(rèn)為，蛋白質(zhì)的體外消化率是指蛋白質(zhì)被蛋白酶水解為肽類(lèi)及氨基酸等可溶性物質(zhì)氮含量占谷物蛋白總氮量的比例[1-3]。基于第二種觀點(diǎn)考慮，加入TCA的目的是沉淀未被降解成小肽及氨基酸的可溶性蛋白質(zhì)。從人體和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)吸收的原理進(jìn)行分析，在酶解液中加入TCA的操作是有道理的，但一定要扣除TCA與胃-胰蛋白酶沉淀所造成的干擾，否則仍然不能得出準(zhǔn)確結(jié)果。

3.2 正確扣除TCA-酶蛋白沉淀的背景值

既然TCA能夠與胃蛋白酶和胰蛋白酶形成沉淀而對(duì)谷物蛋白體外消化率的測(cè)定形成干擾，那么在測(cè)定過(guò)程中就應(yīng)該扣除這一干擾。有文獻(xiàn)采用式（5）計(jì)算谷物蛋白體外消化率[26-29]。

式中：N0為蛋白樣品加入TCA后測(cè)定的不溶性氮 質(zhì)量/mg；Nt為蛋白樣品消化t時(shí)刻加入TCA后的不溶性氮質(zhì)量/mg。

在上述公式中，谷物粗蛋白測(cè)定過(guò)程中也加入了TCA，其目的就是通過(guò)平行操作的方式以扣除TCA的干擾，其實(shí)這種操作沒(méi)有抓住問(wèn)題的關(guān)鍵。因?yàn)樵诠任锎值鞍卓偭繙y(cè)定過(guò)程中，谷物完全在消化管中消化，通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)沒(méi)有任何損失，故在此步驟加TCA沒(méi)有任何作用。而在谷物酶解之后加入TCA，胃蛋白酶和胰蛋白酶會(huì)一同沉淀，外源蛋白（胃-胰蛋白）對(duì)測(cè)定結(jié)果干擾仍然存在。因此，上述處理并沒(méi)有真正扣除胃-胰酶蛋白的空白對(duì)照值。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以大米、玉米、小米、藜麥4 種谷物為研究對(duì)象，采用胃-胰蛋白酶兩步法，在酶解液過(guò)濾前分別進(jìn)行加TCA與不加TCA的對(duì)比研究。結(jié)果表明，不加TCA沉淀酶解液中的可溶性谷物蛋白將導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高，而加入TCA但不扣除胃-胰蛋白酶空白對(duì)照值，則導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。本研究認(rèn)為，采用沉淀法測(cè)定谷物蛋白體外消化率時(shí)，以加入TCA沉淀劑為宜，但在計(jì)算過(guò)程中必須單獨(dú)扣除胃-胰蛋白酶的空白對(duì)照值。