綠桐增殖、生根培養(yǎng)及煉苗移栽研究*

張紅巖，莫勇生，歐 娜，謝 唯，申乃坤

(1.廣西科學(xué)院生物研究所，廣西南寧 530007；2.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530006)

0 引言

綠桐(Paulowniafortunei×Paulowniatomentosa)也叫青桐，是玄參科泡桐屬(Paulownia)植物，因樹皮呈綠色而得名，是由白花泡桐Paulowniafortunei與毛泡桐Paulowniatomentosa通過雜交培育出來的泡桐新品種。綠桐具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長迅速、成材量大、木材物理性能好、可高密度種植等優(yōu)點(diǎn)[1-4]，故其幼苗的市場(chǎng)需求量極大。由于綠桐種子較小且發(fā)芽率低，因此目前主要采用埋根或埋條等無性繁殖方式來獲得綠桐幼苗。但是，綠桐無性繁殖速度慢且需要較大的人力及占地面積，導(dǎo)致在短期內(nèi)難以獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木。另外，在無性繁殖過程中易造成苗木體內(nèi)病毒的“累積”效應(yīng)，致使叢枝病(通過種根和種苗傳播)逐代加重，嚴(yán)重影響綠桐的生長速度和成材率。通過組織培養(yǎng)技術(shù)快速獲得大量的綠桐組培苗，可以解決當(dāng)前在種植區(qū)苗木帶菌率高、病害隨繁殖材料傳播蔓延等問題，滿足當(dāng)前市場(chǎng)需求。有關(guān)泡桐屬其他樹種的組織培養(yǎng)研究較多，如范國強(qiáng)等對(duì)白花泡桐的愈傷誘導(dǎo)[5]及體細(xì)胞胚誘導(dǎo)[6-8]等組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，認(rèn)為泡桐最適誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L萘乙酸(NAA)+14 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)；幼芽生根最優(yōu)培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA。劉飛等[9]對(duì)組培苗離體開花體系進(jìn)行了研究?？椎聫V等[10]采取溫度處理組培苗后結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫去植物菌原體的脫毒方法，既能保證種苗無病，又能保持泡桐原來的優(yōu)良特性。田國忠等以泡桐成年樹上莖段為外植體，獲取再生植株，并結(jié)合莖尖培養(yǎng)方法進(jìn)行脫毒試驗(yàn)[11]，同時(shí)還對(duì)泡桐組培脫毒苗和規(guī)?；a(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和完善[12,13]，結(jié)果表明使用0.1%升汞(HgCl2)對(duì)外植體進(jìn)行消毒(莖尖消毒7-8 min，莖段消毒10-12 min)，消毒效果較好，且對(duì)外植體傷害較小，萌發(fā)較快，易獲得無菌苗；春季營養(yǎng)杯苗移栽適宜時(shí)間為3月中旬至5月初，秋季移栽時(shí)間為8月下旬至10月上旬。楊晨星等[14]對(duì)大巖桐外植體消毒進(jìn)行研究，結(jié)果顯示10% H2O2消毒處理，外植體污染和褐化率較高；消毒效果較好的2個(gè)組合為75%乙醇30 s+0.1% HgCl2消毒10 min和75%乙醇30 s+5% NaClO消毒10 min，該研究為其他類似植物外植體消毒提供參考。江香梅等[15]以“桐優(yōu)1”等3個(gè)泡桐品種的葉片、莖段、根萌條為外植體材料進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)根萌條是建立泡桐無菌體系的理想材料。蘇江等[16]建立白花泡桐的組織培養(yǎng)技術(shù)，認(rèn)為最佳培養(yǎng)基如下：初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，芽誘導(dǎo)率超70%；繼代增殖培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA和MS+0.4 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IBA中交替培養(yǎng)，增殖系數(shù)可達(dá)6.0以上，且芽長勢(shì)健壯，外植體發(fā)生玻璃化的概率小于5%；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA，生根率達(dá)98%以上。這些研究為泡桐的快速擴(kuò)大繁殖奠定了良好技術(shù)基礎(chǔ)，為綠桐的組織培養(yǎng)提供了豐富的理論參考。但由于植物組織培養(yǎng)存在種屬特異性，不同種屬之間差別很大[17]，因此不同泡桐優(yōu)良單株的最優(yōu)組培脫毒技術(shù)和方法也不盡相同[18]。另外，幼苗從生根到室外移栽成活率極低，因此需要對(duì)綠桐組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)一步研究。目前有關(guān)綠桐組織培養(yǎng)的研究還鮮有報(bào)道，加之市場(chǎng)上綠桐組培苗供應(yīng)量小，價(jià)格奇高(每株高達(dá)幾十元)，完全滿足不了市場(chǎng)需求。因此，本研究擬建立綠桐快繁技術(shù)體系，通過對(duì)外植體消毒方式、不定芽誘導(dǎo)及增殖繼代、組培苗生根及室外移栽等因素進(jìn)行系統(tǒng)性研究，為工廠化生產(chǎn)綠桐組培苗提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料綠桐1號(hào)由廣西瑞譜生物科技有限公司提供，選取當(dāng)年生嫩枝或從大樹旁長出的嫩枝作為外植體，取材期為2018年4月。所用瓊脂，蔗糖，MS培養(yǎng)基所需的微量元素、大量元素，有機(jī)物試劑，以及植物生長調(diào)節(jié)劑如6-芐氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA3)、2,4-對(duì)氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

選取健壯的速生綠桐當(dāng)年生枝條。截取前端30 cm左右，剪去葉片，保留葉柄2-3 cm，修整后的枝條置于加有2滴洗潔精的水中浸泡5 min；流水沖洗20 min，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，剪成長4-5 cm且?guī)в幸粋€(gè)或者2個(gè)葉柄的小段，用75%酒精浸泡30 s。然后分成3等份分別進(jìn)行以下處理：(1)0.1%升汞浸泡8 min；(2)10%次氯酸鈉和0.1%升汞等體積混合，浸泡8 min；(3)10%次氯酸鈉和0.1%升汞等體積混合消毒處理5 min，無菌水沖洗1次，然后用0.1%升汞消毒3 min。最后分別用無菌水沖洗3次后待用。每個(gè)處理10瓶，每瓶接種10個(gè)外植體，外植體得率(%)=無污染外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑及其用量對(duì)腋芽萌發(fā)的影響

將消毒外植體(莖段)兩端各斜切小部分并除去葉柄，然后接種于含有不同濃度6-BA (0.8，1.0，1.2 mg/L)、GA3(0，0.8 mg/L)和2,4-D (0.5，1.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)腋芽，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種外植體50個(gè)。培養(yǎng)過程中統(tǒng)計(jì)污染率，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率(%)=萌發(fā)腋芽數(shù)/接種莖段數(shù)×100%。

1.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑及其用量對(duì)不定芽增殖的影響

初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的不定芽離體后，分別接種于含有不同濃度的6-BA (0.6，0.8，1.0，1.2 mg/L)和NAA (0，0.2，0.4 mg/L)的MS增殖培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種不定芽60個(gè)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖系數(shù)，期間定期觀察不定芽的長勢(shì)。

1.2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑及其用量對(duì)不定芽生根的影響

剪取繼代增殖培養(yǎng)中長勢(shì)較好、株高3 cm以上的不定芽，分別接種于含不同濃度的IBA (0.4,0.6,0.8,1.0 mg·L-1)和NAA (0.2,0.4,0.6 mg/L)的1/2 MS生根培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種不定芽50個(gè)，每個(gè)組培瓶接種不定芽5個(gè)。培養(yǎng)15 d后，統(tǒng)計(jì)平均根長、根數(shù)、生根率及芽生長情況。生根率(%)=生根的不定芽數(shù)/接種的總芽數(shù)×100%。

上述培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖，4.5 g/L瓊脂粉，調(diào)整pH值為5.8。培養(yǎng)室溫度為26-28℃，光強(qiáng)為2 200 lx，光照周期為12 h/d。

1.2.5 組培苗室外移栽

組培苗生根培養(yǎng)約30 d后，選擇株高8-10 cm，根長約3 cm且根系發(fā)育良好的綠桐無菌苗，將根部培養(yǎng)基清洗干凈，清洗時(shí)應(yīng)避免根部斷裂或受傷，然后移栽至無菌營養(yǎng)土中。采取以下移栽方式移栽：①直接移栽——將組培移栽至無直射光照室內(nèi)培養(yǎng)7 d，然后室外正常自然光照；②先煉苗后再移栽——將組培苗在自然通風(fēng)及光照條件下的實(shí)驗(yàn)室煉苗7 d，然后移栽并進(jìn)行覆膜保濕7 d，轉(zhuǎn)入室外正常自然光照；③不煉苗，移苗后覆膜——組培苗移苗后覆膜保濕7 d，室外正常自然光照。35 d后統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方法對(duì)綠桐外植體污染及腋芽萌發(fā)的影響

消毒處理方式及消毒時(shí)間對(duì)外植體污染及腋芽萌發(fā)有顯著影響：消毒劑毒性過大或消毒時(shí)間過長，腋芽萌發(fā)慢甚至不萌發(fā)；消毒劑毒性過小或時(shí)間過短，外植體滅菌不徹底，污染率過高。

從表1可以看出，不同消毒方式處理的莖段，其萌發(fā)時(shí)間不同且莖段的顏色也會(huì)受到影響，方法(1)和(2)的萌發(fā)時(shí)間較長，外植體污染率均超過50%，且外植體顏色由最初的深綠色變?yōu)闇\綠色，有的甚至變?yōu)樽厣f明消毒對(duì)外植體傷害較大；方法(3)處理過的莖段得率最高為62%，且腋芽萌發(fā)時(shí)間也最短(12 d)，說明此消毒方法最有效，且對(duì)外植體毒害較小，保證了外植體的成活和誘導(dǎo)效果。因此，消毒方法(3)適用于綠桐莖段的消毒。

表1 消毒處理方法對(duì)綠桐腋芽萌發(fā)的影響

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

在含不同植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，莖段腋芽萌動(dòng)及長勢(shì)差異明顯(表2)。MS培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2,4-D + 0.8 mg/L GA3時(shí)，莖段腋芽誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)78%;誘導(dǎo)時(shí)間約12 d時(shí)，葉柄基部的芽點(diǎn)開始萌動(dòng)，約20 d逐漸生長成不定芽，且長勢(shì)最好，誘導(dǎo)出的不定芽比較健壯。而其他配方誘導(dǎo)率較低，腋芽長勢(shì)弱，萌發(fā)較慢。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)綠桐不定芽增殖的影響

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽切段轉(zhuǎn)接到含不同濃度6-BA和NAA的MS增殖培養(yǎng)基上，不定芽出現(xiàn)時(shí)間及增殖系數(shù)隨著培養(yǎng)基中6-BA、NAA組成及含量的變化而不同(表3)。當(dāng)培養(yǎng)基中無植物生長調(diào)節(jié)劑時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)不定芽增殖。培養(yǎng)基中只添加6-BA時(shí)，莖段均能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L，不定芽增殖系數(shù)最高(1.08)；而其濃度高于1.0 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)開始下降。培養(yǎng)基中只添加NAA時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)不定芽增殖，但接種的不定芽莖段長勢(shì)良好，有明顯的伸長現(xiàn)象，并產(chǎn)生較多的根。當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA和NAA濃度分別為0.8，0.4 mg/L時(shí)，不定芽增殖效果最好，增殖系數(shù)可達(dá)2.02，繼代培養(yǎng)周期約為21 d，不定芽生長粗壯(圖1a)；當(dāng)6-BA和NAA濃度分別為 0.8，0.6 mg/L時(shí)，新的不定芽葉片出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，增殖系數(shù)降低。以上結(jié)果表明：綠桐不定芽增殖的最適植物生長調(diào)節(jié)劑為0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA。

表3 激素(NAA、6-BA)組合對(duì)綠桐不定芽增殖的影響

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)綠桐不定芽生根的影響

剪取株高3 cm以上且?guī)в?片左右葉片的綠桐小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，7 d左右有的小芽基部開始出現(xiàn)白色凸起，然后逐漸成長為根系，15 d后統(tǒng)計(jì)生根實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表4可以看出，不添加任何激素時(shí)，綠桐小芽根點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間晚，根數(shù)量少且長勢(shì)弱；而在添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，小苗的生根率都較高。當(dāng)植物生長調(diào)節(jié)劑組合為0.6 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，以及0.4 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA時(shí)，小芽在8-10 d出現(xiàn)根點(diǎn)，但根生長較慢，粗短、叢生，植株生長也較慢；當(dāng)組合為0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，以及0.8 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA時(shí)，小芽出現(xiàn)根點(diǎn)需要8-10 d，根生長較快，但基部會(huì)有愈傷組織出現(xiàn)，有的根呈海綿狀，植株長勢(shì)旺盛，但不利于后期移栽；當(dāng)植物生長調(diào)節(jié)劑組合為0.6 mg/L NAA +0.4 mg/L IBA時(shí)，7 d即可觀察到大量根長出，培養(yǎng)30 d時(shí)生根率可達(dá)100%，且根長勢(shì)均勻、數(shù)量多且健壯，根系長滿培養(yǎng)基；葉片肥厚，呈深綠色，株高可達(dá)10 cm以上(圖1b)。以上結(jié)果表明，綠桐不定芽生根最適植物生長調(diào)節(jié)劑為0.6 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA。

圖1 綠桐組織培養(yǎng)再生及煉苗

表4 IAA或IBA激素濃度對(duì)不定芽生根的影響

2.5 煉苗及移栽方式對(duì)綠桐無菌苗成活的影響

煉苗及不同的移栽方式對(duì)綠桐幼苗成活率有顯著影響(表5)。移栽方式①中，綠桐幼苗未經(jīng)煉苗，且未進(jìn)行任何保濕措施，綠桐無菌苗成活率較低，只有35%；方式③雖然進(jìn)行了膜覆蓋保濕保溫處理，但未進(jìn)行煉苗，綠桐無菌苗成活率為52%；而移栽方式②先對(duì)綠桐幼苗進(jìn)行自然光煉苗處理后再移苗，并用保濕膜覆蓋，以保持幼苗濕度和溫度，其存活率可達(dá)92%(圖1c)。綠桐幼苗生長2個(gè)月可高達(dá)30 cm，可進(jìn)行移栽(圖1d)。

表5 不同移栽方法對(duì)綠桐幼苗存活率的影響

3 討論

3.1 消毒方式對(duì)綠桐外植體消毒效果影響

獲得無菌外植體是植物組織培養(yǎng)成功的必要前提，常通過化學(xué)藥劑如酒精、升汞、次氯酸鈉等對(duì)植物材料表面進(jìn)行消毒，不同消毒方式對(duì)植物的消毒機(jī)理和傷害不同，消毒劑及消毒時(shí)間對(duì)植物外植體的消毒效果、存活率及出芽率有顯著影響[5]。為降低對(duì)外植體的傷害且達(dá)到消毒目的，通常將消毒劑組合使用。另外，消毒時(shí)間過長對(duì)外植體的毒害作用較大，會(huì)褐化外植體或者直接將其殺死，進(jìn)而使腋芽無法萌發(fā)，無法建立組培體系；若消毒時(shí)間過短，則無法獲得無菌外植體[19]。田國忠等[12]研究發(fā)現(xiàn)，酒精對(duì)泡桐外植體傷害較大，消毒劑可以只用0.1%升汞，但污染率偏高。本研究在借鑒前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)綠桐消毒方式進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只是用酒精，消毒效果較差且容易褐化，這與前人研究結(jié)果一致[11,18]；當(dāng)使用3種消毒劑組合(先用75%酒精消毒后，再用10%的次氯酸鈉與0.1%升汞等體積混合液消毒，最后用0.1%升汞消毒)時(shí)，外植體污染率低于40%，且受到的傷害最小，易于腋芽萌發(fā)，這與一些文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[14]。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑在綠桐組織培養(yǎng)中的作用

植物生長調(diào)節(jié)劑的組成及濃度對(duì)離體組織的誘導(dǎo)、增殖及生根等生長發(fā)育起關(guān)鍵作用[20]。其中細(xì)胞分裂素可引起細(xì)胞分裂并誘導(dǎo)芽的萌發(fā)和生長，生長素則促進(jìn)植物細(xì)胞伸長和根系分化。在特定范圍內(nèi)，外植體芽的誘導(dǎo)、增殖及根的分化由細(xì)胞分裂素與生長素的種類和濃度決定[21]。本研究發(fā)現(xiàn)6-BA對(duì)綠桐不定芽產(chǎn)生起到關(guān)鍵作用，不添加6-BA時(shí)無法誘導(dǎo)出不定芽，這與一些研究結(jié)果類似[5,14]。但單純的6-BA不利于綠桐芽的誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)率較低，芽生長比較緩慢；而6-BA過高時(shí)，雖可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽，但玻璃化嚴(yán)重；本實(shí)驗(yàn)在借鑒前人研究[10,13]的基礎(chǔ)上，通過額外添加激素GA3，獲得最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D+0.8 mg/L GA3，該培養(yǎng)基配方提高了綠桐出芽誘導(dǎo)率，且芽生長健壯。另外，在生根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)：NAA濃度偏高會(huì)導(dǎo)致綠桐組培苗產(chǎn)生大量愈傷組織和畸形根，而過低又會(huì)導(dǎo)致生根率偏低、生根慢，且根比較細(xì)弱，這與許多報(bào)道類似[5,21,22]。在添加NAA的基礎(chǔ)上，再添加0.4 mg/L IBA，可使綠桐生根率達(dá)100%，且植株更加健壯和整齊，所以綠桐生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+0.6 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA，這與前人報(bào)道[5,9]稍有出入，可能是不同基因型和外植體差異造成。

3.3 綠桐組培苗移栽

植物組培苗的煉苗和移栽是快繁體系最后一個(gè)核心環(huán)節(jié)。移栽成活率的高低直接影響組培快繁的生產(chǎn)成本[23]。組培苗不經(jīng)過煉苗直接進(jìn)行移栽，由于植株過于幼嫩，移栽后易引起爛根死亡，影響幼苗的成活率[24]?；|(zhì)的選擇、滅菌及移栽后的保溫、保濕等措施對(duì)苗的成活也起到重要作用。試管苗比較幼嫩，從無菌轉(zhuǎn)入有菌環(huán)境生長，如果沒有滅菌、保濕等保護(hù)性措施就很難抵御外界雜菌的侵染及干燥等復(fù)雜環(huán)境，容易染菌或干枯死掉，所以移栽前必須做好基質(zhì)的消毒及移栽后的覆膜保溫、保濕等工作[25]。本實(shí)驗(yàn)中，先對(duì)綠桐組培苗煉苗7 d后再進(jìn)行移栽，移栽后用地膜覆蓋保濕，組培苗成活率可達(dá)92%。

4 結(jié)論

本研究對(duì)綠桐外植體消毒方式、誘導(dǎo)分化及煉苗條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：最佳消毒方式為依次采用75%乙醇、等體積10%次氯酸鈉與0.1%升汞混合液、0.1%升汞消毒；選擇當(dāng)年生嫩條頂端10 cm長度的莖段為最佳外植體；外植體在MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D+0.8 mg/L GA3的培養(yǎng)基中，能誘導(dǎo)出長勢(shì)健壯的不定芽；在MS+0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA的增殖培養(yǎng)基中，增殖系數(shù)達(dá)2.02；而生根以1/2 MS+0.6 mg/L IBA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基為最佳，生根率可達(dá)100%；組培苗煉苗后移栽，再進(jìn)行覆膜保濕，移栽存活率可達(dá)92%。本研究建立了一整套綠桐快速繁殖體系，為后期綠桐組培苗大規(guī)模生產(chǎn)打下良好基礎(chǔ)。