LPS脅迫下五個(gè)群體菲律賓蛤仔TYR基因在鰓和肝胰腺中表達(dá)特性研究

劉 杰 , 聶鴻濤 , 姜坤銀 , 王政興 , 孫曉彤 , 霍忠明 , 閆喜武

(1. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2. 大連海洋大學(xué) 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)是我國(guó)重要水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類。2017年我國(guó)蛤仔年產(chǎn)量約為4 177 913萬(wàn)噸, 在貝類養(yǎng)殖中有著重要地位[1]。然而近年來(lái), 弧菌病成為威脅養(yǎng)殖業(yè)的主要原因之一[2]。例如, 鰻弧菌和燦爛弧菌是我國(guó)海水養(yǎng)殖所面臨的重要致病菌, 嚴(yán)重威脅經(jīng)濟(jì)貝類的養(yǎng)殖安全[3-4]。菲律賓蛤仔免疫與病害防治一直是菲律賓蛤仔養(yǎng)殖的重中之重。蛤仔的免疫力強(qiáng)弱即抵抗外來(lái)病原體脅迫能力的強(qiáng)弱直接決定著蛤仔的存活率。因此, 開(kāi)展蛤仔免疫相關(guān)基因研究對(duì)提高蛤仔產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益有著重要意義。

酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)(E.C.1.14.18.1)是一種含銅元素氧化還原酶, 屬于3型銅蛋白家族, 酪氨酸酶屬于酚氧化酶的一種[5-6]。酪氨酸酶催化黑色素生物合成過(guò)程中的前兩個(gè)反應(yīng), 包括從酪氨酸中產(chǎn)生的真黑色素和非黑色素, 即將酪氨酸羥基化為二羥基-L-苯丙氨酸(DOPA), 然后將DOPA氧化為多巴胺[7-8]。其參與生物體色素合成, 在軟體動(dòng)物中, 一些頭足類動(dòng)物被用作研究墨囊中黑色素生物合成的生化特性的良好模型[9-11]。在長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)發(fā)育中酪氨酸酶參與了殼形成[12]。同時(shí), 酪氨酸酶也是一種重要的免疫相關(guān)酶[13]。目前已發(fā)現(xiàn)其在多種海洋生物中參與免疫應(yīng)答, 在無(wú)脊椎動(dòng)物的先天免疫中也起著關(guān)鍵作用[13-15]。在貝類中, 長(zhǎng)牡蠣和櫛孔扇貝中含有酪氨酸酶, 它的活性被認(rèn)為與長(zhǎng)牡蠣和櫛孔扇貝的免疫力有關(guān)[13,16-19]。例如, LPS刺激后在櫛孔扇貝血淋巴中TYR基因表達(dá)水平先顯著下調(diào)后顯著上調(diào)(P<0.05), 在LPS刺激后3h, 血淋巴對(duì)大腸桿菌的抗菌活性也顯著增加, 但在用TYR抑制劑處理血淋巴后, 其抗菌活性顯著降低[20]。在翡翠貽貝中也有酪氨酸酶基因參與免疫應(yīng)答的研究報(bào)道[21]。然而, 在蛤仔中對(duì)酪氨酸酶基因與免疫的潛在關(guān)聯(lián)研究很少。

LPS是革蘭氏染色陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖, 在許多雙殼類免疫相關(guān)文獻(xiàn)中記錄了革蘭氏染色陰性菌是影響雙殼類存活的主要病原體[16]。在雙殼類中, 鰓是與外界海水連續(xù)交換的器官, 是蛤仔第一道天然屏障, 因此容易受到病原體感染, 肝胰腺是貝類的重要的免疫器官[22-23]。本實(shí)驗(yàn)選取鰓和肝胰腺兩個(gè)組織探究了TYR基因?qū)Ψ坡少e蛤仔的免疫應(yīng)答, 利用熒光定量PCR分析了LPS脅迫下蛤仔TYR6和TYR10基因的表達(dá)特性。為深入探究菲律賓蛤仔免疫作用與TYR基因之間的關(guān)系提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的五個(gè)菲律賓蛤仔群體: 野生群體(Wild Population)、養(yǎng)殖群體(Cultured Population)、斑馬蛤(Zebra clam)、白斑馬蛤(White Zebra clam)、白蛤(White clam)。斑馬蛤由福建莆田野生菲律賓蛤仔群體選育而來(lái), 白斑馬蛤通過(guò)大連野生群體白蛤和斑馬蛤雜交而來(lái), 白蛤和養(yǎng)殖菲律賓蛤仔來(lái)自莆田群體, 上述四種實(shí)驗(yàn)蛤仔均來(lái)自莊河養(yǎng)殖場(chǎng)2齡貝, 殼長(zhǎng)22.2±1.02 mm, 濕重5.4±0.8 g。野生群體采自大連金石灘。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將實(shí)驗(yàn)樣品置于20 L水槽中22℃暫養(yǎng)一周, 每天換水一次, 適量投喂螺旋藻粉。

1.2 LPS脅迫及組織獲取

將五個(gè)群體菲律賓蛤仔, 隨機(jī)分為兩組, 每個(gè)群體每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)抽取三個(gè)個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一組為L(zhǎng)PS脅迫組, 注射50 μL(濃度為100 μg/mL)的LPS。另一組設(shè)為PBS對(duì)照組, 注射50 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)。每個(gè)群體進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)隨機(jī)選取3個(gè)個(gè)體進(jìn)行注射脅迫, 于0、3、6、12、24、48 h, 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)解剖獲得實(shí)驗(yàn)蛤仔的鰓和肝胰腺組織, 液氮冷凍后存于–80℃冰箱用于提取樣品總RNA。

1.3 RNA提取及序列分析

取30mg組織使用TRIzol法獲得實(shí)驗(yàn)用蛤仔鰓組織及肝胰腺組織總RNA。用NanoDrop 2000c UV核酸定量?jī)x進(jìn)行RNA濃度檢測(cè)。用TaKaRa Primer ScriptTMRT reage-nt Kit(TaKaRa, 大連)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。從本實(shí)驗(yàn)室菲律賓蛤仔基因組中選取核心序列TYR6(>evm.model.xfSc0000366.24)、TYR10(>evm.model. xfSc0000339.13), 將蛋白序列上傳到 NCBI, 在NCBI中進(jìn)行TYR蛋白序列比對(duì)分析, 將同源性高的物種的氨基酸序列下載下來(lái), 使用Clustal X進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行分析, 找到6個(gè)組氨酸殘基[24]; 使用線上軟件ExPASy(htps: //www.expasy.org/)研究物種序列二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系[25]。通過(guò)MEGA X軟件研究菲律賓蛤仔與不同物種間遺傳進(jìn)化關(guān)系, 并以發(fā)育樹(shù)進(jìn)行展示Bootstrap 1000次(Neighbor-Joining, NJ)[26-27]。

1.4 TYR基因熒光定量PCR分析

根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)用Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性熒光引物(表1), 交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物, 引物退火溫度 60℃, 以β-actin為內(nèi)參基因。檢測(cè)TYR基因在鰓和肝胰腺中不同時(shí)間的表達(dá)情況。使用SYBR?Premix Ex試劑盒(TaKaRa, 大連)在 LightCycler?480 定量 PCR 儀(Roche, 上海)進(jìn)行序列擴(kuò)增, 20 μL體系, 每組進(jìn)行三次重復(fù)(表2)。實(shí)驗(yàn)用兩步法熒光定量PCR程序:循環(huán)40次。將所得結(jié)果用 2–ΔΔCt法計(jì)算分析比較, 并進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 用SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。設(shè)置P<0.05為表達(dá)量差異顯著性水平。

表1 熒光定量引物 Tab. 1 Primers for real-time PCR

表2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)體系 Tab. 2 Quantitative real-time PCR detecting system

2 結(jié)果

2.1 菲律賓蛤仔TYR蛋白序列多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

使用線上軟件ExPASy對(duì)序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 得到2個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn), 和6個(gè)組氨酸殘基(圖1)。

五個(gè)群體菲律賓蛤仔的TYR6、TYR10基因的氨基酸序列與其他物種TYR基因在Clustal X上多序列比對(duì), 其TYR6與長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)同源性最高為39.43%, 在進(jìn)化樹(shù)中最先聚為一支, 與蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)同源性為36.02%, 其次與三角帆蚌同源性為35%。TYR10與大珠母貝(Pinctada maxima)同源性最高為51.04%, 與加勒比珠母貝(Pinctada imbricata)同源性為49.31%, 因此TYR10和大珠母貝(Pinctada maxima)、加勒比珠母貝(Pinctada imbricata)最先聚為一支, 其次與金烏賊(Sepia officinalis)聚為一支, 再與其他貝類聚成一支, 最后才與脊椎動(dòng)物聚為一大支(圖2)。

圖1 TYR氨基酸多序列比對(duì) Fig. 1 Multiple alignment of TYR amino acid sequences.

圖2 TYR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) Fig. 2 Phylogenetic tree of TYR genes

2.2 TYR 基因在五個(gè)群體蛤仔鰓和肝胰腺組織中的表達(dá)模式

注射LPS后TYR6基因在養(yǎng)殖群體鰓組織中隨時(shí)間增加表達(dá)量有顯著變化(P<0.05), 3h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始上調(diào), 6 h、12 h與0 h相比差異顯著, 分別是對(duì)照組的9.19和8.64倍(P<0.05), 且6 h表達(dá)量達(dá)到最高, 隨時(shí)間推移24 h表達(dá)量下調(diào), 48 h表達(dá)量趨于初始水平(圖3); 在肝胰腺中6h表達(dá)量顯著上調(diào), 是對(duì)照組的21.88倍(P<0.05), 隨后表達(dá)量下調(diào)。TYR6基因在白蛤鰓組織中3 h、6 h、12 h表達(dá)量顯著上調(diào), 分別是對(duì)照組的3.22倍、5.16倍和3.51倍(P<0.05), 且在6 h表達(dá)量達(dá)到峰值, 在24 h表達(dá)量下調(diào)趨近于初始水平(圖3); 在肝胰腺中, 6 h表達(dá)量顯著上調(diào)是對(duì)照組的15.99倍(P<0.05), 隨后表達(dá)量下調(diào)。在24 h表達(dá)量達(dá)到另一峰值是對(duì)照組的7.24倍(P<0.05)(圖4)。TYR6基因在白斑馬蛤鰓組織中, 3 h、6 h、12 h均有顯著上調(diào), 在6 h表達(dá)量達(dá)到峰值是對(duì)照組的3.19倍(P<0.05), 24 h表達(dá)量下調(diào)趨于初始水平(圖3); 在肝胰腺中6 h顯著上調(diào)達(dá)到峰值是對(duì)照組的27.17倍(P<0.05), 12 h下調(diào)至初始水平(圖4)。TYR6基因在野生群體鰓組織中, 3 h表達(dá)量顯著上調(diào)達(dá)到峰值, 是對(duì)照組的6.46倍(P<0.05), 之后下調(diào)至初始水平(圖3); 在肝胰腺中3 h表達(dá)量顯著上調(diào)達(dá)到峰值, 是對(duì)照組的4.87倍(P<0.05)(圖4)。TYR6基因在斑馬蛤鰓組織中3 h、 6h表達(dá)量顯著上調(diào), 分別是對(duì)照組的 7.1倍和2.72倍(P<0.05), 并于3 h達(dá)到峰值, 6 h表達(dá)量開(kāi)始下調(diào); 在肝胰腺中3 h表達(dá)量顯著上調(diào)達(dá)到峰值, 是對(duì)照組的8.12倍(P<0.05), 隨后開(kāi)始下調(diào)于48 h趨于初始水平。

圖3 LPS脅迫下菲律賓蛤仔鰓組織TYR6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式 Fig. 3 Expression patterns of TYR6 gene in the gill of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

圖4 LPS脅迫下菲律賓蛤仔肝胰腺TYR6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式 Fig. 4 Expression patterns of TYR6 gene in the hepatopancreas of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

注射LPS后, TYR10基因在養(yǎng)殖群體鰓組織中3 h、6 h表達(dá)量顯著上調(diào), 分別是對(duì)照組的6.35倍和14.74倍(P<0.05), 在6h表達(dá)量達(dá)到峰值, 隨后表達(dá)量下調(diào)到初始水平(圖5); 在肝胰腺中, 6 h表達(dá)量顯著上調(diào)達(dá)到峰值是對(duì)照組的7.55倍(P<0.05)(圖6)。TYR10基因在白蛤鰓組織中3 h表達(dá)量顯著上調(diào)達(dá)到峰值是對(duì)照組的4.23倍(P<0.05), 隨后下調(diào)至初始水平; 在肝胰腺中3 h顯著上調(diào)并達(dá)到峰值, 是對(duì)照組的2.63倍(P<0.05)。TYR10基因在白斑馬群體鰓組織中3h表達(dá)量顯著上調(diào)達(dá)到峰值, 是對(duì)照組的5.88倍(P<0.05)(圖5); 在肝胰腺中6 h表達(dá)量顯著上調(diào)達(dá)到峰值是對(duì)照組的19.85倍(P<0.05), 隨后下調(diào)至初始水平(圖6)。TYR10基因在野生群體鰓組織中3h表達(dá)量顯著上調(diào)并達(dá)到峰值, 是對(duì)照組的6.7倍(P<0.05) (圖5); 在肝胰腺中3 h、6 h、12 h表達(dá)量均有顯著上調(diào), 分別是對(duì)照組的9.22倍、20.32倍和10.51倍(P<0.05), 在6 h表達(dá)量達(dá)到峰值(圖6)。TYR10基因在斑馬蛤鰓組織中3 h、12 h表達(dá)量顯著上調(diào), 分別是對(duì)照組的6.89倍和4.74倍(P<0.05), 3 h表達(dá)量達(dá)到峰值(圖5); 在肝胰腺中6 h顯著上調(diào)達(dá)到峰值是對(duì)照組的21.08倍(圖6)。

圖5 LPS脅迫下菲律賓蛤仔鰓TYR10基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式 Fig. 5 Expression patterns of TYR10 gene in the gill of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

圖6 LPS脅迫下菲律賓蛤仔肝胰腺TYR10基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式 Fig. 6 Expression patterns of TYR10 gene in the hepatopancreas of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

3 討論

近年來(lái)的研究表明, 酪氨酸酶參與了軟體動(dòng)物的許多生物學(xué)功能, 包括免疫應(yīng)答、卵囊形成、足絲、殼基質(zhì)蛋白和角質(zhì)層形成等[28-29,12]。本實(shí)驗(yàn)中, 在LPS注射后TYR6、TYR10基因在五個(gè)蛤仔群體中鰓組織和肝胰腺組織中均有差異性表達(dá), 從表達(dá)量結(jié)果來(lái)進(jìn)行分析, TYR6白斑馬鰓組織中的表達(dá)量在3h、6h、12h均有顯著上調(diào)(P<0.05)。TYR10在五個(gè)群體菲律賓蛤仔中斑馬蛤肝胰腺中表達(dá)量最高(圖6), 可能跟斑馬蛤本身的抗逆性強(qiáng)有關(guān)[30]。除TYR6在養(yǎng)殖群體鰓組織中未有顯著上調(diào), TYR基因在四個(gè)群體鰓組織中3h表達(dá)量均有顯著上調(diào)(P<0.05), 比在肝胰腺中顯著上調(diào)時(shí)間出現(xiàn)要早, 推測(cè)菲律賓蛤仔在受到LPS注射后鰓組織較肝胰腺組織更為敏感。雙殼類的鰓不僅是呼吸器官, 也是重要的免疫器官, 其與外界海水連續(xù)交換, 易被病原體感染[9]。推測(cè)TYR基因有可能在鰓組織中參與了免疫反應(yīng)。TYR基因在蛤仔肝胰腺中的表達(dá)水平普遍要高于在鰓中的表達(dá)水平, LPS脅迫后TYR基因的高表達(dá)表明TYR基因可能在肝胰腺中參與了蛤仔的免疫應(yīng)答反應(yīng), 在其他物種中也有類似的報(bào)道[22-24]。

Mu?oz等[31]研究發(fā)現(xiàn), 在雙殼類血淋巴和血細(xì)胞中, 寄生蟲(chóng)侵染可以使酪氨酸酶活性顯著上調(diào)。周智等[23]研究發(fā)現(xiàn)TYR基因在櫛孔扇貝血淋巴中的表達(dá)水平?jīng)Q定血淋巴抗菌活性的強(qiáng)弱, 證明了酪氨酸酶參與了貝類天然免疫反應(yīng)。Rishan[32]等研究表明, 在菲律賓蛤仔血淋巴中只含有一種酚氧化酶, 屬于一種酪氨酸酶型酚氧化酶。酚氧化酶是無(wú)脊椎動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分, 是絲氨酸蛋白酶復(fù)合酶級(jí)聯(lián)的末端組成部分。

綜上, 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR分析了LPS脅迫下TYR基因在菲律賓蛤仔5種群體的鰓和肝胰腺中的表達(dá)水平。查明了TYR基因在LPS脅迫下的鰓組織和肝胰腺組織中的表達(dá)模式, 同時(shí)推測(cè)了TYR基因在蛤仔鰓和肝胰腺中表達(dá)與免疫的關(guān)系, 從TYR基因免疫應(yīng)答水平上看, 不同群體TYR表達(dá)的高低與蛤仔免疫力表達(dá)有一定聯(lián)系, TYR6、TYR10基因在斑馬蛤鰓組織和肝胰腺組織中均有較高表達(dá), 推測(cè)與斑馬蛤是抗逆性強(qiáng)品系, 抗病能力要強(qiáng)于其他群體有關(guān)。為進(jìn)一步對(duì)菲律賓蛤仔免疫學(xué)的研究提供基礎(chǔ)。