急性熱應(yīng)激對大菱鲆血液生化指標的影響

孟 振, 張鴻麗, 劉新富, 賈玉東, 劉 濱, 曲江波

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 山東 青島 266071; 2. 暨南大學 赤潮與海洋生物學研究中心, 廣東 廣州 510632; 3. 煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司, 山東 煙臺 264006)

溫度是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最關(guān)鍵的環(huán)境因素之一, 養(yǎng)殖水溫的任何變化都可能影響魚類的行為、生化和正常生理活動[1-3]。已有研究表明, 熱應(yīng)激會對魚類產(chǎn)生不利影響, 包括代謝紊亂[4,5]、氧化應(yīng)激[6,7]、免疫力和抗病力的急劇下降[8,9]等。血液作為魚類循環(huán)系統(tǒng)重要的組成部分, 高溫脅迫引發(fā)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡等變化會在魚類血液指標上有所體現(xiàn), 同時血液生理生化指標也能夠客觀地反映機體的應(yīng)激狀態(tài)和抗應(yīng)激調(diào)控機制, 血液理化指標也由此被廣泛應(yīng)用于評估魚類生理健康程度和對環(huán)境的適應(yīng)能力[10-12]。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是一種冷溫性比目魚(Pleuronectiformes)類, 現(xiàn)已發(fā)展成為中國、歐洲和美洲的重要海水養(yǎng)殖品種。適應(yīng)低水溫生活和生長是其突出特點, 實踐證明對于10~15 cm的大規(guī)格魚種, 在5℃的水溫條件下仍可保持較積極的攝食狀態(tài), 其最適生長水溫在13℃~20℃, 而且隨苗種規(guī)格的增加, 其最適生長水溫范圍不斷降低, 長期處于23℃以上水溫條件下影響其生長率和成活率[13,14]。當前, 中國大菱鲆養(yǎng)殖模式主要為室內(nèi)工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖, 養(yǎng)殖范圍由北方的環(huán)渤海三省一市輻射至福建沿海, 而且因其相對完整的產(chǎn)業(yè)鏈條、養(yǎng)殖效益和市場認可度, 又是未來深遠海養(yǎng)殖的最佳適養(yǎng)品種。在全球氣候變暖和極端天氣頻發(fā)的情況下, 夏季高溫已成為威脅大菱鲆健康養(yǎng)殖的重要因素。高溫應(yīng)激對大菱鲆的影響近年來也引起研究者的重視, 應(yīng)激標志物的選擇主要集中于體表黏液[15]和氧化應(yīng)激指標[16], 缺乏對血液理化指標的廣泛調(diào)研。

本研究通過急性熱應(yīng)激, 檢測溫度和時間雙因素作用下血液神經(jīng)內(nèi)分泌激素、血糖、抗氧化和非特異性免疫指標的動態(tài)變化, 以期分析大菱鲆響應(yīng)熱應(yīng)激的反應(yīng)策略和抗熱應(yīng)激調(diào)控機制, 為大菱鲆耐高溫選育和養(yǎng)殖中發(fā)展抗高溫調(diào)控措施提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗在煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司進行, 幼魚為公司培育的全同胞苗種, 苗種培育馴化溫度為18±1℃, 規(guī)格為全長21.98 cm±0.53 cm、體質(zhì)量183.65 g± 15.99 g。選擇體質(zhì)健壯、活力強、規(guī)格整齊的幼魚, 實驗前在實驗水槽暫養(yǎng)48 h, 水溫18±0.5℃, 暫養(yǎng)期間不投餌。

1.2 實驗條件及控溫方式

實驗水槽實際水體300 L, 實驗用水為紫外線消毒的砂濾海水, pH 7.85, 鹽度29.5, TAN<0.1 mg/L。溫度以鈦加熱棒(1 000 W)和控溫儀(HXSWT-210, 大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司)控制, 控溫精度±0.5℃, 實驗期間微流水(換水量約3次/d), 正常充氣, 保持溶氧6.5 mg/L以上。

1.3 高起始致死溫度

設(shè)定18℃、21℃、24℃和27℃ 4個溫度梯度, 每個溫度設(shè)置3個平行樣, 每個平行樣放入同規(guī)格大菱鲆幼魚10尾, 初始溫度為18±0.5℃過濾海水, 按1℃/h的升溫速率, 升到預(yù)設(shè)溫度, 以溫度達到預(yù)設(shè)值為時間零點, 進行96 h高溫脅迫實驗, 實驗結(jié)束后統(tǒng)計各溫度組實驗魚累計死亡率, 利用Probit 回歸分析獲得96 h死亡率達到50%的溫度值, 作為大菱鲆大規(guī)格苗種高起始致死溫度(96 h UILT50, Upper Incipient Lethal Temperature 50)[17]。實驗期間不投餌, 觀察記錄大菱鲆的行為反應(yīng), 每4 h測量1次水溫、溶解氧和pH, 每24 h記錄各平行樣死亡個體數(shù)量, 并及時剔除死亡個體, 魚體死亡以碰觸15 s內(nèi)無反應(yīng)為準。

1.4 熱應(yīng)激試驗

采用上述溫度梯度及實驗操作, 評估熱應(yīng)激對大菱鲆大規(guī)格幼魚血液生化指標的影響, 每個試驗組設(shè)3個平行樣, 每個平行樣放入上述同規(guī)格大菱鲆幼魚30尾。

1.4.1 血液樣品采集

在脅迫試驗的0、3、6、9、12、24、48、72和96 h隨機取樣采血, 每次每組平行樣各隨機取樣2尾, 共6尾魚。采血后將魚體放入暫養(yǎng)池, 不再放回原試驗水槽, 以避免對同一條魚重復取樣。

為減少采血操作對結(jié)果的影響, 取樣時將魚迅速撈起, 并立即投入質(zhì)量濃度為200 mg/L的MS-222海水中進行快速深度麻醉(10 s~15 s碰觸無反應(yīng)), 尾靜脈釆血。采血注射器及離心管均用20 μL的1%肝素鈉溶液浸潤、烘干、冷卻后使用。采集血樣在4℃保溫箱中靜置, 以4℃、4 000 r/min離心10 min制備血漿, 血漿于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血液樣品分析

使用Elisa法(上海酶聯(lián), 中國)測定血漿皮質(zhì)醇(Cortisol, Fish Cortisol Elisa Kit ml003467)和腎上腺素(EPI, Fish EPI Elisa Kit ml920078)濃度; 使用微量酶標法(南京建成, 中國)檢測血漿堿性磷酸酶(AKP)和還原型谷胱甘肽(GSH)濃度/活性; 使用羥胺法(南京建成, 中國)檢測血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性; 使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(南京建成, 中國)檢測血漿葡萄糖(GLU)濃度。操作方法參照試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)分析

大菱鲆96 h的UILT50和95%可信區(qū)間使用SPSS 17.0軟件以概率單位加權(quán)回歸(Probit)法求出。血漿生化指標數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示, 利用SPSS 17.0軟件雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進行檢驗, 并采用Tukey’s多重比較分析同一溫度不同時間和同一時間不同溫度組間的差異, P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 行為反應(yīng)

大菱鲆大規(guī)格幼魚對急性熱應(yīng)激脅迫產(chǎn)生明顯的行為反應(yīng), 高溫組魚體行為響應(yīng)時間提前, 反應(yīng)程度劇烈。對照組(18℃)大菱鲆整個試驗周期都相對安靜伏底, 泳速、泳態(tài)正常, 體色無明顯變化; 21℃組實驗初期(0~12 h)魚體相對安靜, 24 h后游泳頻率高于18℃組, 泳速、泳態(tài)、體色正常; 24℃組實驗早期(12 h)魚體即表現(xiàn)煩躁, 游動頻繁, 尤其喜歡向水面游動, 后期體色變淺, 體表特有的色素斑點更加明顯; 27℃組實驗早期(9 h)魚體不停在中上水層游動, 易受驚嚇, 體色明顯變淺, 同時體表色素斑點突出; 高溫組(24℃、27℃)實驗后期魚體運動頻率明顯下降, 且有不同比例的個體反應(yīng)遲鈍, 死亡個體癥狀表現(xiàn)為口張大或微張, 鰓蓋閉合。

2.2 高起始致死溫度(UILT50)

對照組96 h內(nèi)實驗魚全部存活, 無異常反應(yīng)。其他實驗組升溫過程中(升溫時長3 h~9 h)均未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 急性熱應(yīng)激對大菱鲆的致死效應(yīng)見表1, 21℃組僅1尾個體在48 h內(nèi)出現(xiàn)死亡, 24℃和27℃組在24 h~96 h內(nèi)有不同比例的死亡率, 死亡率隨溫度升高不斷上升。SPSS 17.0軟件以概率單位加權(quán)回歸(Probit)法求出大菱鲆96 h的高起始致死溫度為28.05℃, 95%置信區(qū)間為26.52℃~31.84℃。

表1 大菱鲆的急性高溫脅迫致死效應(yīng)和高起始致死溫度 Tab. 1 Acute temperature stress and upper incipient lethal temperature 50 (UILT50) leads to lethality in juvenile turbot

2.3 對血液生化指標的影響

2.3.1 對神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的影響

溫度和脅迫時間均對大菱鲆血漿腎上腺素(EPI)含量變化有顯著影響, 且兩者存在顯著的交互作用(圖1)。同一溫度下, 除18℃組外, 熱應(yīng)激組血漿EPI含量隨脅迫時間的延長均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢; 同一脅迫時間, 21℃組血漿EPI含量自12 h后始終維持最高值, 且顯著高于對照組(P<0.05), 24℃和27℃組EPI含量則基本與對照組相當, 實驗早期(6 h~12 h)則顯著低于對照組水平(P<0.05)。

血漿皮質(zhì)醇(Cortisol)含量受溫度、脅迫時間和兩者交互作用的顯著影響(圖2)。18℃組血漿血漿皮質(zhì)醇含量始終維持較低的水平, 熱應(yīng)激組血漿血漿皮質(zhì)醇含量隨脅迫時間延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢, 均在48 h達到最高值; 同一脅迫時間, 24℃和27℃組血漿皮質(zhì)醇含量隨溫度變化響應(yīng)時間相應(yīng)提前, 于脅迫后3 h或6 h即顯著高于對照組(P<0.05), 21℃組血漿血漿皮質(zhì)醇含量響應(yīng)時間滯后, 至脅迫后9 h顯著高于對照組(P<0.05), 24 h和48 h含量也顯著高于24℃和27℃組(P<0.05), 達對照組2倍多。

圖1 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿腎上腺素含量的影響 Fig. 1 Effect of acute temperature pressure on plasma EPI content in turbot

2.3.2 對血糖含量的影響

血漿血糖(GLU)含量受溫度、脅迫時間及交互作 用的顯著影響(圖3)。同一溫度條件下, 18℃組GLU含量維持相對一致的表達水平, 實驗后期GLU含量略微下降, 但差異不顯著(P>0.05); 21℃組血糖含量隨脅迫時間呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢, 48 h后GLU含量顯著高于脅迫前(P<0.05); 高溫組(24℃和27℃)GLU含量隨脅迫時間呈先升后降的趨勢, 3 h~9 h即顯著高于脅迫前, 至96 h下降至最低值。同一脅迫時間下, GLU含量與溫度有關(guān), 實驗早期(0~24 h), GLU含量與溫度呈正相關(guān), 27℃組快速(6 h)達到最高值, 約為對照組的1.5倍, 實驗后期(48 h~96 h), 熱應(yīng)激組GLU含量與溫度呈負相關(guān), 21℃組GLU含量處于最高值, 而24℃和27℃組GLU則快速下降至極低水平, 顯著低于21℃組(P<0.05)。

2.3.3 對氧化應(yīng)激參數(shù)的影響

溫度和脅迫時間顯著影響血漿還原型谷胱甘肽(GSH)的含量變化, 但兩者無顯著性交互作用(圖4)。同一溫度下, 18℃組血漿GSH實驗周期內(nèi)無顯著性變化, 21℃組除48 h顯著降低外, 其他時間也沒有顯著性變化, 24℃和27℃組GSH含量則隨時間延長逐漸降低, 脅迫初期(0~3 h)顯著高于脅迫后期(24 h或96 h后)(P<0.05)。同一脅迫時間下, 4個溫度組僅脅迫起始時(0 h), 27℃組血漿GSH含量顯著高于其他實驗組(P<0.05), 此后, 各溫度組血漿GSH含量無顯著性差異(P>0.05)。

血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性受溫度、時間及交互作用的顯著影響(圖5), 其影響作用主要表現(xiàn)在脅迫初期, 在脅迫0~3 h內(nèi)血漿SOD活性與溫度呈正相關(guān), 且隨脅迫時間延長而升高(P<0.05), 脅迫6 h后, 各溫度組和各脅迫時間除個別點外, 均無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿皮質(zhì)醇含量的影響 Fig. 2 Effect of acute temperature pressure on plasma Cortisol content in turbot

圖3 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿葡萄糖含量的影響 Fig. 3 Effect of acute temperature pressure on plasma GLU content in turbot

圖4 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿還原型谷胱甘肽含量的影響 Fig. 4 Effect of acute temperature pressure on plasma GSH content in turbot

圖5 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿超氧化物歧化酶活性的影響 Fig. 5 Effect of acute temperature pressure on plasma SOD activity in turbot

2.3.4 對非特異性免疫能力的影響

血漿堿性磷酸酶(AKP)活性受溫度、脅迫時間及交互作用的顯著影響(圖6)。同一溫度下, 18℃組和21℃組AKP活性96 h內(nèi)無顯著性變化, 24℃和27℃組在24 h內(nèi)也無顯著性變化, 24 h后隨脅迫時間延長逐漸升高。同一脅迫時間, 熱應(yīng)激組AKP活性在9 h內(nèi)稍低于對照組, 差異不顯著(P>0.05), 12 h顯著低于對照組AKP活性(P<0.05), 48 h后熱應(yīng)激組AKP活性則顯著高于對照組(P<0.05), 且升高幅度與溫度呈正相關(guān)。

3 討論

魚類作為變溫動物, 環(huán)境溫度變化直接影響機體的新陳代謝過程, 適溫范圍內(nèi)溫度升高, 魚類游泳、呼吸頻率、攝食等行為強度增大, 生理活動增強, 代謝旺盛, 但溫度超過其適溫范圍, 則會導致代謝紊亂, 直至機體死亡[18]。作者通過高溫脅迫實驗, 對大菱鲆幼魚死亡率和行為反應(yīng)進行比較, 結(jié)果表明: 在18℃馴養(yǎng)溫度和1℃/h的升溫速率下, 熱應(yīng)激組(24℃和27℃)大菱鲆實驗早期均表現(xiàn)出游動頻繁、煩躁和呼吸急促的特點, 而后期則逐漸降低游動頻率, 直至喪失躲避風險的能力, 96 h高起始致死溫度(UILT50)為28.05℃。大菱鲆對急性熱應(yīng)激的行為反應(yīng)與大黃魚(Larimichthys crocea)[19]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[20]等游泳性魚類相似, UILT50低于許氏平鲉(Sebastes schlegelii)和大瀧六線魚(Hexagrammos otakii)等冷溫性魚類[17], 但稍高于木云雷[21]等報道的大菱鲆稚魚24 h UILT50(26.54℃), 這可能與不同的升溫方式有關(guān), 作者采用1℃/h的升溫速率, 而后者采用了突變高溫脅迫的方法, 多數(shù)研究也已證實同種魚類UILT50受到個體因素、馴化溫度、升溫速 率和水質(zhì)條件等多種因素的協(xié)同作用[3,17]。

圖6 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿堿性磷酸酶活性的影響 Fig. 6 Effect of acute temperature pressure on plasma AKP activity in turbot

Bartons[22]把魚類對環(huán)境壓力應(yīng)激的初級階段定義為神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng), 有兩條內(nèi)分泌調(diào)節(jié)途徑, 一是交感-嗜鉻組織系統(tǒng), 常被急性脅迫激活, 特別是應(yīng)激伴隨或者涉及血氧含量的顯著降低, 通過釋放腎臟嗜鉻細胞組織中儲存的兒茶酚胺類激素, 導致血漿兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素水平的快速增加[23]。二是下丘腦-垂體-腎間組織軸(HPI軸), 激活下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腎間組織皮質(zhì)類固醇激素的級聯(lián)釋放, 導致血漿皮質(zhì)醇含量的升高[24]。已有研究表明, 溫度急性應(yīng)激導致虹鱒[25]、許氏平鲉[26]、大黃魚[19]和裂腹魚(Schizothorax prenanti)[27]等多種魚類皮質(zhì)醇的短期快速升高, 皮質(zhì)醇也因此被認為是魚類溫度應(yīng)激反應(yīng)的初始指示器[11,28]。本研究中, 同其他魚類一樣, 急性熱應(yīng)激組大菱鲆血漿皮質(zhì)醇快速升高, 脅迫初期皮質(zhì)醇升高的響應(yīng)時間與溫度明顯相關(guān), 溫度越高, 響應(yīng)時間提前, 血漿皮質(zhì)醇含量隨脅迫時間延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢, 各脅迫組均在24 h~48 h達到最高值, 至96 h仍顯著高于對照組。血漿EPI含量則未表現(xiàn)類似的趨勢, 高溫組(24℃和27℃)含量脅迫早期(6 h~12 h)顯著低于對照組, 而其他時間與對照組無顯著差異, 僅21℃組48 h后顯著高于對照組。由此推測, HPI軸調(diào)節(jié)作用在大菱鲆急性溫度脅迫反應(yīng)中其主導作用, 血漿皮質(zhì)醇可以作為溫度應(yīng)激反應(yīng)的內(nèi)分泌激素標志物。本實驗中血漿皮質(zhì)醇含量的變化規(guī)律也表明, 對于24℃和27℃熱應(yīng)激組在脅迫初期(3 h~6 h)檢測血液血漿皮質(zhì)醇含量即可準確體現(xiàn)大菱鲆的應(yīng)激狀態(tài), 而21℃組則需推遲至9 h以后, 以24 h~48 h的含量作為敏感指標最為有效, 血漿皮質(zhì)醇變化規(guī)律也與大菱鲆行為變化相對應(yīng), 24℃和27℃熱應(yīng)激組在脅迫初期(0~12 h)即表現(xiàn)出游動頻繁、煩躁不安的應(yīng)激狀態(tài), 血漿皮質(zhì)醇含量也相應(yīng)升高, 21℃組則在24 h后才表現(xiàn)出游動頻繁的特點, 血漿皮質(zhì)醇含量響應(yīng)時間則相對滯后。

血糖(GLU)是魚類最重要的能源物質(zhì), 主要來源于肝糖原分解和糖異生作用兩方面, 正常狀態(tài)下其濃度維持相對恒定的水平, 對機體生理狀態(tài)變化和外界環(huán)境因子刺激非常敏感, 是重要的生理、病理和毒理學指標[11]。本研究中, 高溫(24℃和27℃)脅迫初期大菱鲆血糖含量快速升高, 于脅迫后3 h~6 h即達最高值, 其后則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢, 而21℃實驗組則呈現(xiàn)不同的變化趨勢, 脅迫24 h內(nèi)無顯著性變化, 48 h后顯著升高。這是由于溫度對魚類血糖的影響普遍認為, 在適溫范圍內(nèi), 溫度升高, 機體代謝旺盛, 血糖含量升高, 健康狀況良好; 當超過最適溫度, 實驗初期環(huán)境溫度急劇變化時, 機體表現(xiàn)出運動頻率增加、呼吸速率加快的行為變化, 亟需能量物質(zhì)的供應(yīng), 應(yīng)激脅迫刺激HPI軸釋放皮質(zhì)醇進入循環(huán)系統(tǒng), 促使肝糖原降解速率加快和糖異生作用增強, 血糖的升高滿足高溫導致機體能量代謝水平上升的需求, 而隨著脅迫時間延長, 血糖被消耗以供應(yīng)能量, 肝糖原被大量分解, 導致血糖含量顯著降低[19,25]。同時, 48 h后熱應(yīng)激組血漿血漿皮質(zhì)醇含量呈現(xiàn)下降趨勢, 也暗示實驗魚可能處于應(yīng)激后適應(yīng)調(diào)整階段, 相關(guān)研究也表明魚類血糖與皮質(zhì)醇之間存在相互調(diào)節(jié)機制, 皮質(zhì)醇可以通過調(diào)節(jié)肝臟、腎臟組織相關(guān)酶活性的變化, 使糖異生反應(yīng)受阻, 使得血糖水平進一步降低, 而高血糖癥狀又可以反饋調(diào)節(jié)血漿皮質(zhì)醇的持續(xù)升高[29,30]。本實驗中大菱鲆血糖變化是否存在熱應(yīng)激后適應(yīng)調(diào)節(jié)機制, 則需要對熱應(yīng)激過程中HPI軸組織血漿皮質(zhì)醇合成酶、葡萄糖降解酶和異生酶等相關(guān)基因表達水平和酶活變化規(guī)律進行深入研究。溫度對魚類血糖含量的影響在多種魚類得到相似的結(jié)論[11,25,26], 血糖可以作為大菱鲆溫度急性脅迫的良好指標, 與血漿皮質(zhì)醇指標的變化規(guī)律相似, 24℃和27℃熱應(yīng)激組在脅迫初期(3 h~6 h)檢測血糖含量, 即可準確反映溫度應(yīng)激狀態(tài), 且血糖含量高低與脅迫溫度正相關(guān), 21℃則需延遲至48 h后血糖含量才顯著升高。

溫度同樣影響魚類抗氧化能力, 水溫升高會提高魚類新陳代謝速率, 導致機體耗氧率的增加, 促使氧自由基(ROS)的產(chǎn)生, 從而導致氧化壓力, 引起機體抗氧化反應(yīng)[31]。大量研究表明, 魚類暴露于溫度脅迫下其血清抗氧化酶活性常呈現(xiàn)增加的趨勢, 如暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)[6]和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[32]等。本研究中, 高溫急性脅迫下, 大菱鲆血漿SOD酶活和GSH含量均在脅迫初期(0~6 h)呈現(xiàn)顯著的上升趨勢, 表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激的生理狀態(tài), 但脅迫6 h后, 血漿SOD酶活和GSH含量隨脅迫時間延長無顯著變化趨勢, 也未表現(xiàn)出與溫度梯度的相關(guān)性, 同一取樣時間各溫度組間無顯著性差異。Lu[16]等通過大菱鲆高溫敏感型家系和耐高溫家系的溫度脅迫實驗, 也證實耐高溫家系在溫度(25.5℃和29.5℃)脅迫初期(0 h和6 h)血清SOD酶活呈顯著上升趨勢, 而25.5℃組SOD酶活0、6、24 h間無顯著性差異, 與本研究結(jié)果相似, 高溫脅迫初期血漿SOD酶活上升, 而脅迫后期SOD酶活未表現(xiàn)出顯著性變化。究其原因, 可能與脅迫初期, 高溫導致的ROS快速積累, 亟需依賴血清抗氧化系統(tǒng)清除多余的自由基, 促使抗氧化酶活性增加, 而隨著脅迫的延長, 肝臟可能成為抗氧化酶促反應(yīng)的主要場所, 正如低溫脅迫對云紋石斑魚肝臟和血清抗氧化指標影響的研究報道相似[33], 肝臟抗氧化酶活力增加, 血清抗氧化酶活力則無顯著性變化。高溫對大菱鲆氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響仍需深入研究, 其血漿SOD酶活和GSH含量不能準確反應(yīng)機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

堿性磷酸酶(AKP)是魚類重要的非特異性免疫標志酶, 存在于多種魚類組織, 具有防御和消化的雙重作用, 也是重要的代謝調(diào)控酶, 參與磷酸基團轉(zhuǎn)運和代謝、鈣磷調(diào)節(jié)等, 其含量受環(huán)境變化的影響, 反映了魚類應(yīng)激狀態(tài)[34]。溫度脅迫對魚類血清AKP活性的影響研究相對較少, 對虹鱒[22]和銀鯧(Pampus argenteus)[35]的熱應(yīng)激研究結(jié)果表明, 血清AKP活性隨溫度升高呈下降趨勢。本研究中, 脅迫初期(12 h內(nèi))高溫組血漿AKP活性不斷下降, 至12 h顯著低于對照組, 表明高溫急性脅迫初期, 機體調(diào)控代謝能力下降, 48 h后脅迫組AKP活性明顯上升, 顯著高于對照組, 且升高幅度與溫度呈正相關(guān), 可能是由于大菱鲆重要代謝組織肝臟經(jīng)急性溫度脅迫后產(chǎn)生損傷或出現(xiàn)障礙, 內(nèi)源性AKP大量釋放經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)進入血液有關(guān)[34], 導致血漿AKP酶活短時間快速升高。

綜上所述, 在pH 7.85、鹽度29.5和溶解氧高于6.5 mg/L的環(huán)境條件下, 馴化溫度為18±1℃的大規(guī)格大菱鲆幼魚(平均體質(zhì)量183.65 g±15.99 g), 采用1 /h℃ 的升溫速率, 96 h高起始致死溫度為28.05 ; ℃21℃組血漿皮質(zhì)醇和GLU含量均隨脅迫時間延長呈相對升高的趨勢, 血漿皮質(zhì)醇含量24 h~48 h達最高值, GLU含量則在48 h~72 h達最高值, AKP活性無顯著性變化, 伴隨機體運動頻率的增加, 表明21℃開始出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)并進入適應(yīng)性調(diào)節(jié)狀態(tài); 24℃組脅迫初期(3 h~6 h)血漿皮質(zhì)醇、GLU含量均顯著提升, 脅迫后期GLU迅速降低(48 h)、AKP活性快速上升(72 h), 表明24℃可能是大菱鲆熱應(yīng)激由適應(yīng)性調(diào)節(jié)進入受損狀態(tài)的“關(guān)鍵高溫點”, 伴隨少量個體出現(xiàn)死亡; 27℃組脅迫初期(3 h~9 h)血漿皮質(zhì)醇、GLU含量、GSH含量、SOD活性均顯著性升高, 脅迫后期GLU顯著降低(24 h)、AKP顯著升高(48 h), 暗示肝臟等組織受損嚴重, 死亡比例近40%, 表明27℃是大菱鲆大規(guī)格商品魚養(yǎng)殖過程中高溫耐受上限; 血漿皮質(zhì)醇、GLU和AKP含量/活性可以作為大菱鲆熱應(yīng)激過程的敏感指標。