sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流產(chǎn)中的表達(dá)及意義

謝素娟，肖 迪2，羅 欣2，張 華2，李俊男2，漆洪波2，周 勤

(1.重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院婦科，重慶 401121；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400042)

稽留流產(chǎn)具有一定的特殊性，也稱過期性流產(chǎn)，患者主要臨床表現(xiàn)是妊娠20周以前胚胎已經(jīng)死亡，但仍然滯留在宮腔內(nèi)不能自然排出[1]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，稽留流產(chǎn)患者人數(shù)在逐年上升，其主要和遺傳、感染性疾病、免疫功能、內(nèi)分泌失調(diào)以及孕婦年齡有關(guān)[2-3]。可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1(soluble FMS-like tyrosine kinase-1, sFlt-1)是一種血管形成抑制因子，在滋養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)，尤其是在滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤和分化中sFlt-1表達(dá)顯著增強(qiáng)，sFlt-1異常表達(dá)會導(dǎo)致妊娠異常。目前在異位妊娠、稽留流產(chǎn)、早期異常孕育過程中是否存在sFlt-1的異常表達(dá)有待研究[4]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGF-binding protein 3，IGFBP-3)是胰島素樣生長因子的結(jié)合蛋白，在胎兒的正常發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。妊娠相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)具有激活補(bǔ)體的特點，起到免疫抑制作用，避免胎兒遭受母體的排斥，在流產(chǎn)、胚胎發(fā)育遲緩以及伴有其他妊娠早期并發(fā)癥的患者血清中PAPP-A水平顯著降低[6]。目前臨床關(guān)于稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制尚未明確。本研究通過分析sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流產(chǎn)中的表達(dá)及意義，探討稽留流產(chǎn)的原因，以期為其防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年6月至2017年6月在重慶市兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院院接受治療的稽留流產(chǎn)患者40例納入稽留流產(chǎn)組；選取早期流產(chǎn)患者40例納入早期流產(chǎn)組；另外選取進(jìn)行體檢的健康妊娠期產(chǎn)婦20例作為正常組。3組研究對象臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 3組患者臨床資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均自然受孕；正常組超聲檢查顯示孕囊、胎芽或胎心與孕期相符；稽留流產(chǎn)組患者均符合稽留流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，超聲檢查顯示胎囊無胎芽和胎心，胚胎發(fā)育與孕期不相符，胚胎停止發(fā)育后2個月不能自然排出；早期流產(chǎn)組患者符合早期流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即妊娠不足12周，胎兒體質(zhì)量不足1 000 g。排除標(biāo)準(zhǔn)：染色體、生殖器官、免疫功能異?；颊?；感染性疾病患者；惡性腫瘤患者；慢性婦科炎癥患者。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象及其家屬均知情，并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 收集3組研究對象的絨毛組織。在無菌環(huán)境下采用負(fù)壓吸引術(shù)將絨毛組織吸出，負(fù)壓設(shè)置為400～500 mmHg。當(dāng)孕囊吸出后，馬上將絨毛組織進(jìn)行分離，使用無菌生理鹽水清洗表面血液，沖洗干凈之后使用濾紙將組織上的水分吸干，在凍存管內(nèi)保存，15 min之內(nèi)將標(biāo)本組織在-80 ℃環(huán)境下保存，待測。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A表達(dá) 采用50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20 μg/mL，加入至96孔酶標(biāo)板中,每孔100 μL，4 ℃過夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入1%的BSA 150 μL，在37 ℃環(huán)境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀釋度的血清，加入對照樣品，37 ℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μL,稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次，使用顯色劑顯色20 min后在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值，從而測定sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A的陽性表達(dá)情況。

1.2.3 免疫組化染色處理 將石蠟切片樣本放在二甲苯中脫蠟處理10 min，將二甲苯更換后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修復(fù)液，在37 ℃的恒溫冰箱中孵化30 min，棄抗原修復(fù)液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的H2O2，去過氧化物酶封閉，恒溫冰箱孵育10 min后采用PBS沖洗；加入適量的山羊血清，在室溫環(huán)境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS沖洗；經(jīng)過DAB顯色處理10 min，能夠在顯微鏡下觀察到棕黃色陽性反應(yīng)，則采用PBS沖洗1 min；使用蘇木精復(fù)染3 min，然后用濃度為1%的鹽酸乙醇分化處理，自來水沖洗1 min后，脫水并封片處理。

1.3 結(jié)果判定

每個樣本在鏡頭下隨機(jī)選擇5個視野，視野中IGFBP-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)及sFlt-1蛋白陽性細(xì)胞數(shù)小于20%的樣本定義為陰性樣本，陽性細(xì)胞數(shù)為20%及以上定義為陽性樣本。PAPP-A在胞漿和細(xì)胞核中顯示為棕黃色顆粒的為陽性細(xì)胞，樣本中陽性細(xì)胞數(shù)小于5%為陰性樣本，陽性細(xì)胞數(shù)5%及以上定義為陽性樣本。 所有病理切片均由2位以上的經(jīng)驗豐富的醫(yī)師進(jìn)行確診。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A表達(dá)

各組免疫組化染色情況見圖1。正常組sFlt-1表達(dá)水平為(0.50±0.08)，顯著低于早期流產(chǎn)組(1.32±0.22)和稽留流產(chǎn)組(1.02±0.10)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而稽留流產(chǎn)組患者sFlt-1表達(dá)水平也低于早期流產(chǎn)患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。正常組IGFBP-3表達(dá)水平為(1.48±0.30)，顯著高于早期流產(chǎn)組(0.36±0.06)和稽留流產(chǎn)組(1.06±0.12)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；稽留流產(chǎn)組患者IGFBP-3表達(dá)水平高于早期流產(chǎn)患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。正常組PAPP-A表達(dá)水平為(1.45±0.26)，顯著高于早期流產(chǎn)組(0.32±0.04)和稽留流產(chǎn)組(1.25±0.20)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；稽留流產(chǎn)組患者PAPP-A表達(dá)水平高于早期流產(chǎn)患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A表達(dá)水平比較(免疫組化 ×200)

*：與正常組比較，P<0.05;#：與早期流產(chǎn)組比較，P<0.05

2.2 sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流產(chǎn)中聯(lián)合檢測

sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三項聯(lián)合檢測的敏感度、準(zhǔn)確度高于sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A單一檢測，特異度低于sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A單一檢測，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流產(chǎn)中聯(lián)合檢測(%)

3 討論

稽留流產(chǎn)形成是因為胚胎在子宮內(nèi)停止發(fā)育，稽留過久會導(dǎo)致凝血功能障礙、胚胎在子宮內(nèi)壁粘連，增加清宮難度，進(jìn)而引發(fā)患者子宮穿孔等并發(fā)癥[8-11]。通過有效的方式對稽留流產(chǎn)進(jìn)行診斷，對患者來說具有重要意義。及時發(fā)現(xiàn)胚胎停育可提前終止妊娠，降低并發(fā)癥發(fā)生率[12]。

sFlt-1是一種血管內(nèi)皮生長因子的特異性受體，通過與VEGF競爭性結(jié)合，對信號傳遞有阻斷作用，從而抑制血管形成[13]。sFlt-1在人體中異常表達(dá)主要與拮抗血管生成有關(guān)。妊娠期sFlt-1主要在胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在滋養(yǎng)細(xì)胞植入子宮蛻膜組織過程中起到協(xié)助作用[14-15]。有研究指出，正常妊娠時，隨著絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量和胎盤體積的增加，sFlt-1表達(dá)逐漸升高[16]。在早期妊娠中，sFlt-1表達(dá)異常會抑制滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量增加，阻礙胎盤形成，導(dǎo)致子宮螺旋小動脈循環(huán)出現(xiàn)障礙，胚胎停止發(fā)育。本研究顯示，稽留流產(chǎn)組患者的sFlt-1表達(dá)水平高于正常孕婦，其原因是sFlt-1異常表達(dá)，加快了VEGF滅活，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜間的血管形成障礙，最終胚胎停止發(fā)育[17]。本研究中早期流產(chǎn)患者sFlt-1表達(dá)水平高于稽留流產(chǎn)患者，說明早期流產(chǎn)sFlt-1對VEGF血管的形成抑制作用顯著。Martínez-Ruiz等[18]認(rèn)為，sFlt-1異常升高會對胚胎著床部位的血管形成產(chǎn)生障礙，引發(fā)不良妊娠結(jié)局，在早期的稽留流產(chǎn)中具有重要的意義。

IGFBP-3主要以復(fù)合體的形式參與血液循環(huán)，大分子三聚體通過毛細(xì)血管屏障具有一定的障礙，在IGFBP-3蛋白分解作用下，會促進(jìn)復(fù)合體釋放IGF，有助于IGF通過血管內(nèi)皮屏障，作用于組織血管[19-20]。IGFBP-3的生成受到促生長素的影響，其水平變化主要和患者的年齡有關(guān)。研究顯示，在青少年時期，IGFBP-3會達(dá)到最大值，女性患者IGFBP-3水平顯著高于同齡男性患者，而在肥胖、糖尿病、肝功能異?；颊咧?，IGFBP-3水平較低[21-22]。本研究結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)組患者的IGFBP-3表達(dá)水平高于早期流產(chǎn)患者，低于正常組，說明IGFBP-3在稽留流產(chǎn)過程中具有一定的診斷價值。

PAPP-A是一種大分子糖蛋白，主要由胎盤和蛻膜產(chǎn)生，在妊娠期過程中PAPP-A大量產(chǎn)生，被釋放到母體血液中，參與血液循環(huán)[23-25]。研究顯示，PAPP-A濃度的變化與孕周有關(guān)，孕婦的孕期增加，PAPP-A水平不斷升高，一直到產(chǎn)后，PAPP-A水平下降，在產(chǎn)后6周血清中基本檢測不到PAPP-A[26-27]。Smith等[28]指出，PAPP-A和胎盤的功能以及胎盤的成熟程度有關(guān)，在正常妊娠孕婦中PAPP-A水平與胎盤的質(zhì)量、胎兒的體質(zhì)量具有正相關(guān)性，血清中PAPP-A水平直接反映胚胎的成熟程度，顯示胎兒的生長發(fā)育情況。本研究顯示，稽留流產(chǎn)組患者的PAPP-A表達(dá)水平高于早期流產(chǎn)患者，低于正常組。分析其原因為當(dāng)胎盤絨毛發(fā)育出現(xiàn)異常時，滋養(yǎng)細(xì)胞功能會降低，PAPP-A水平也逐漸下降，導(dǎo)致患者流產(chǎn)。有學(xué)者指出，孕婦血清中的PAPP-A濃度高低在胎兒畸形、高危妊娠診斷中發(fā)揮著重要作用[29-30]。

此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A單一檢測對于稽留流產(chǎn)診斷的敏感度為70%～75%，而sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三項聯(lián)合檢測敏感度達(dá)到94.87%，明顯高于任何單一檢測的診斷效果。同時，sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A單一檢測對于稽留流產(chǎn)診斷的準(zhǔn)確度為71%～75%，也明顯低于sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三項聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確度(84.48%)，說明sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三項聯(lián)合檢測在稽留流產(chǎn)中具有較高的診斷價值。

綜上所述，sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A聯(lián)合檢測對稽留流產(chǎn)的診斷價值較高，sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A的異常表達(dá)參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)展，為稽留流產(chǎn)的治療提供一定的借鑒。