兩段式發(fā)酵法中曬露階段醬醪理化情況的研究

董亮,張晶,葉碧霞,左勇*

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000;2.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400030)

甜面醬是以面粉作為原料，經(jīng)蒸煮糊化后，人工接種曲種(常用滬釀3.042)制曲[1]，再拌入適量鹽水進(jìn)行發(fā)酵而成的半固態(tài)調(diào)味品。甜面醬的生產(chǎn)方式主要是基于拌鹽水后發(fā)酵方式的不同進(jìn)行劃分，常用的發(fā)酵方式有自然曬露發(fā)酵方式和人工保溫發(fā)酵[2,3]。根據(jù)目前生產(chǎn)實(shí)際的情況，現(xiàn)有的兩種生產(chǎn)方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，前者傳統(tǒng)自然曬露發(fā)酵生產(chǎn)的甜面醬色澤鮮亮、香氣濃郁、滋味鮮甜咸適宜，但因其發(fā)酵過程中始終依靠外界環(huán)境的溫度促使發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵過程緩慢進(jìn)行，原料降解緩慢，從而使得發(fā)酵周期較長，通常需1年以上成熟，影響企業(yè)的產(chǎn)能提升。而保溫發(fā)酵通過控制發(fā)酵溫度，使得原料快速降解，發(fā)酵周期短，但該方式生產(chǎn)的甜面醬成品色澤較淡，酯香與醬香不夠協(xié)調(diào)，同時(shí)醬體較稀，成品質(zhì)量不足以媲美傳統(tǒng)自然曬露發(fā)酵所生產(chǎn)的甜面醬[4]。基于現(xiàn)有的兩種生產(chǎn)方式所提出的兩段式發(fā)酵法即先保溫發(fā)酵后自然曬露發(fā)酵的生產(chǎn)方式在面醬的生產(chǎn)應(yīng)用上具有一定前景[5,6]。甜面醬制曲優(yōu)勢微生物主要為霉菌，其在制曲階段大量繁殖并分泌各種酶類，如淀粉酶、蛋白酶等，多種酶類共同作用分解原料中的淀粉和蛋白質(zhì)，形成的小分子糖類、多肽及氨基酸進(jìn)一步參與各種化學(xué)反應(yīng)促使甜面醬成色、生香以及構(gòu)成甜面醬的獨(dú)特滋味[7-10]。

目前，對于兩段式發(fā)酵技術(shù)的深入研究鮮有報(bào)道?；谇捌趯啥问桨l(fā)酵法的初步研究結(jié)果表明，保溫階段主要為大分子糖類及蛋白質(zhì)的快速降解。保溫20～40 d后則可結(jié)束保溫發(fā)酵，進(jìn)入下一階段即自然曬露階段發(fā)酵。本研究以前期保溫發(fā)酵后再進(jìn)行自然曬露發(fā)酵的甜面醬作為研究對象，研究甜面醬后期自然曬露過程中理化指標(biāo)的變化情況，并結(jié)合曬露過程中醬體感官形態(tài)的變化情況，以確定甜面醬兩段式發(fā)酵成熟的生產(chǎn)周期，以期為甜面醬后期曬露發(fā)酵工藝的改善提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

取分別保溫發(fā)酵20，25，30，35，40 d后的甜面醬進(jìn)行曬露階段的研究，樣品分別編號(hào)為1，2，3，4，5。以各自曬露開始時(shí)間計(jì)為0，取樣時(shí)間設(shè)置為0，5，8，14，22，34，49，68 d。

工藝流程：面粉、水→拌和→蒸煮→冷卻→接種(曲精)→制曲→拌鹽水→保溫發(fā)酵(一定時(shí)間)→一次磨醬→曬露發(fā)酵→二次磨醬→檢驗(yàn)→包裝。

1.2 儀器

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pHS-3C酸度計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；臺(tái)式高速微量離心機(jī) 大龍創(chuàng)新試驗(yàn)儀器(北京)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 理化值的測定

總酸及氨基酸態(tài)氮的測定：采用直接滴定和甲醛滴定法；還原糖含量的測定：采用斐林法[11]。

2.2 酶活力的測定

淀粉酶活力的測定：采用碘量法[12]；中性和酸性蛋白酶活力的測定：依據(jù)國標(biāo)法測定[13]。

2.3 感官形態(tài)記錄

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10296-2009要求，感官形態(tài)記錄涵蓋甜面醬的色澤、香氣、滋味與體態(tài)。

2.4 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較[14]。在0.05水平上檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性，試驗(yàn)結(jié)果利用Origin作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 甜面醬曬露階段總酸及pH的變化情況

甜面醬中酸度主要源自微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸、氨基酸等[15]。有機(jī)酸是酯類物質(zhì)生成的基礎(chǔ)底物，適量的有機(jī)酸生成對面醬的呈香具有重要作用，但過量的有機(jī)酸會(huì)嚴(yán)重影響甜面醬的風(fēng)味的品質(zhì)[16]。評價(jià)甜面醬的質(zhì)量通常依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10296-2009所規(guī)定的指標(biāo)進(jìn)行，其中甜面醬的感官特性中關(guān)于滋味的描述中，明確要求無酸味。故甜面醬發(fā)酵過程中，需要嚴(yán)格控制醬醪酸度，因而通過測定醬醪酸度變化情況反映發(fā)酵狀況。經(jīng)保溫發(fā)酵一定時(shí)間的甜面醬，采用陶質(zhì)瓦缸(缸口加一不銹鋼篩蓋)盛裝，置于室外開放環(huán)境下，進(jìn)行日曬夜露發(fā)酵，定期進(jìn)行翻醅處理。

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注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示總酸含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示pH值差異顯著(P<0.05)；a～e分別代表1～5號(hào)樣品在曬露階段的總酸與pH變化情況。

由圖1中a可知，經(jīng)保溫發(fā)酵20 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量先上升后趨于平穩(wěn)，pH值隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低。0～22 d，甜面醬總酸含量逐漸上升(P<0.05)，從1.5%上升到1.85%，22 d后總酸含量上升趨勢減緩，曬露發(fā)酵68天時(shí)，醬醪中總酸含量達(dá)到1.97%。pH值則由曬露初期的4.75下降到曬露后期的3.7。

由圖1中b可知，經(jīng)保溫發(fā)酵25 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量逐漸增加，pH值則逐漸降低。醬醪總酸含量從1.46%增加到1.68%；pH值從4.78下降為4.02。

由圖1中c可知，經(jīng)保溫發(fā)酵30 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量逐漸上升，pH值隨之降低。醬醪總酸含量由1.48%上升至2.13%，該階段總酸含量增加了0.65%。pH值從4.33降低到3.65。

由圖1中d可知，經(jīng)保溫發(fā)酵35 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量隨著曬露時(shí)間的延長而增加，pH值則逐漸下降。總酸含量由1.61%上升到2.05%。醬醪pH值由4.12下降到3.7，降低趨勢較緩慢。

由圖1中e可知，經(jīng)保溫發(fā)酵40 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量呈上升趨勢，pH值則相應(yīng)下降?？偹岷繌?.69%迅速上升為2.25%(P<0.05)，該階段總酸含量增加了0.56%；醬醪的pH值則由4降低為3.6。

圖1結(jié)果表明，兩段式發(fā)酵甜面醬曬露階段，醬醪中總酸含量逐漸增加，pH值相應(yīng)降低。分析造成酸度逐漸上升的原因有：曬露階段，環(huán)境中微生物進(jìn)入醬醪，微生物發(fā)酵產(chǎn)酸以及原料中蛋白質(zhì)水解生成的氨基酸會(huì)造成醬醪中總酸含量逐漸上升。曬露發(fā)酵68 d后的甜面醬中總酸含量最低的是2號(hào)樣品，約為1.68%，pH值為4.02；總酸含量最高是5號(hào)樣品，約為2.25%，pH值為3.6，1，3，4號(hào)樣品中總酸含量分別為1.97%、2.13%、2.05%，pH值分別為3.88，3.65，3.7。

3.2 甜面醬曬露階段還原糖與淀粉酶活力的變化情況

還原糖主要源自原料水解。在甜面醬發(fā)酵過程中，一部分還原糖作為乳酸、酒精發(fā)酵等底物生成有機(jī)酸類物質(zhì)和高級醇等，一部分還原糖作為微生物生長的碳源，還有一部分參與色素的形成[17]。淀粉酶能夠催化原料中淀粉質(zhì)降解為小分子還原糖，因而其在甜面醬發(fā)酵過程中起著重要作用。

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注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示還原糖含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示淀粉酶活力差異顯著(P<0.05)；a～e分別為1～5號(hào)樣品曬露階段的還原糖與淀粉酶活力變化情況。

由圖2中a可知，經(jīng)保溫發(fā)酵20 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，曬露過程中，醬醪中還原糖含量先緩慢上升后略微下降直至穩(wěn)定，淀粉酶活力則逐漸降低。0～14 d，還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，醬醪中還原糖含量從25.92%上升到29.58%；14～34 d，醬醪中還原糖含量略微下降到27.81%，此后還原糖含量整體變化不顯著(P>0.05)，其含量維持在27.8%左右。淀粉酶活力從50.78 U/g下降到6.58 U/g，整個(gè)曬露階段淀粉酶活力降低了44.2 U/g。曬露前期，還原糖含量有所增加，其原因在于此階段淀粉酶活力仍發(fā)揮作用，繼續(xù)催化原料中的淀粉質(zhì)物質(zhì)進(jìn)一步降解為小分子還原糖類。曬露發(fā)酵14 d，測得醬醪中還原糖含量達(dá)到峰值，之后還原糖含量開始下降，原因有：其一，還原糖部分作為微生物代謝碳源；其二，還原糖參與焦糖色素生成；其三，還原糖通過酒精、乳酸等發(fā)酵生成有機(jī)酸、高級醇等物質(zhì)。曬露后期，醬醪中還原糖含量維持穩(wěn)定的主要原因在于：醬醪酸度增大，微生物活動(dòng)降低，還原糖消耗降低，基本維持穩(wěn)定。

由圖2中b可知，經(jīng)保溫發(fā)酵25 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中還原糖含量先上升后降低至基本穩(wěn)定，淀粉酶活力則逐漸降低。0～14 d，甜面醬中還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，其含量從26.12%上升到29.58%，此階段還原糖含量增加了3.46%。14～22 d，此階段還原糖含量有所降低，從29.58%減小至28.68%；此后，隨著曬露時(shí)間的延長，醬醪中還原糖含量整體變化不顯著(P>0.05)，曬露發(fā)酵68 d后，醬醪中還原糖含量約為28.57%。0～14 d，淀粉酶活力從43.46 U/g迅速下降到11.27 U/g；14～68 d，該階段淀粉酶活力緩慢降低;68 d時(shí)，淀粉酶活力約為5.85 U/g。

由圖2中c可知，經(jīng)保溫發(fā)酵30 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中還原糖含量先上升后緩慢降低，淀粉酶活力逐漸降底。0～8 d，還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，醬醪中還原糖含量約由26.55%上升至28.19%，此階段還原糖含量增加了1.64%。此后，隨著曬露時(shí)間的延長，醬醪中還原糖含量逐漸降低，從28.19%下降為27.14%。甜面醬中淀粉酶活力從34.61 U/g降低至3.85 U/g。

由圖2中d可知，經(jīng)保溫發(fā)酵35 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露過程中，醬醪中還原糖含量先緩慢上升后逐漸降低，淀粉酶活力逐漸下降。0～5 d，甜面醬中還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，其還原糖含量從27.32%增加為28.15%。此后，隨著曬露時(shí)間的延長，醬醪中還原糖含量逐漸降低，由28.15%下降為27.46%。0～68 d，淀粉酶活力從27.56 U/g減小到5.34 U/g。

由圖2中e可知，經(jīng)保溫發(fā)酵40 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露過程中，醬醪中還原糖含量略有降低，淀粉酶活力則逐漸降低。還原糖含量從27.25%減少為26.21%；淀粉酶活力從15.51 U/g逐漸下降至2.56 U/g。

圖2結(jié)果表明，甜面醬曬露階段還原糖含量均先逐漸上升后有所降低，而淀粉酶活力則逐漸下降至穩(wěn)定?？傮w來看，原料中淀粉質(zhì)物質(zhì)降解為還原糖使得其含量逐漸上升，同時(shí)曬露階段微生物的發(fā)酵作用會(huì)利用部分還原糖，故還原糖含量變化較小，這是后期還原糖含量維持穩(wěn)定的原因。曬露階段淀粉酶活力降低，其原因有：隨著曬露進(jìn)行，醬醪中水分含量降低，微生物數(shù)量減少，醬醪酸度加大，使得淀粉酶活力受到抑制，同時(shí)高鹽的環(huán)境進(jìn)一步抑制酶活力。甜面醬先經(jīng)保溫發(fā)酵不同時(shí)間后，再進(jìn)行曬露發(fā)酵68 d，其中還原糖含量最高的是2號(hào)樣品，約為28.57%；還原糖含量最低是樣品5，其含量約為26.21%，1，3，4號(hào)樣品中還原糖含量分別約為27.81%、27.14%、27.46%。

3.3 甜面醬曬露階段氨基酸態(tài)氮與蛋白酶活力的變化情況

氨基酸態(tài)氮的含量一定程度上反映蛋白質(zhì)的水解程度，甜面醬中氨基酸主要源自蛋白酶水解蛋白生成，其作為重要的風(fēng)味成分，部分氨基酸提供呈味作用，同時(shí)氨基酸還會(huì)通過美拉德反應(yīng)參與面醬的成色[18,19]。

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注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示氨基酸態(tài)氮含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示酸性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)；不同希臘字母表示中性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)；a～e分別為1～5號(hào)樣品在曬露階段的氨基酸態(tài)氮與蛋白酶活力變化情況。

由圖3中a可知，經(jīng)保溫發(fā)酵20 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態(tài)氮含量先上升后略微下降至基本穩(wěn)定，而蛋白酶活力則在整個(gè)曬露階段均呈現(xiàn)下降趨勢。0～8 d，此階段醬醪中氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升，8 d時(shí)氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大約為0.44%。8～68 d，氨基酸態(tài)氮含量從0.44%逐漸降低為0.41%。曬露階段，中性蛋白酶活力從63.49 U/g降低到6.42 U/g，酸性蛋白酶活力則由101.15 U/g減少為31.56 U/g。

由圖3中b可知，經(jīng)保溫發(fā)酵25 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升至基本穩(wěn)定，蛋白酶活力則逐漸降低。0～8 d，該階段甜面醬中氨基酸態(tài)氮含量由0.39%上升至0.43%；8～68 d，氨基酸態(tài)氮含量從0.43%緩慢降低至0.41%。通過顯著性差異分析可知，5～68 d，該曬露階段中氨基酸態(tài)氮含量無顯著性差異(P>0.05)，表明在曬露過程中氨基酸態(tài)氮含量無顯著性變化。0～68 d，中性蛋白酶活力從38.21 U/g降低到9.65 U/g，酸性蛋白酶活力則由92.32 U/g減少為42.33 U/g。

由圖3中c可知，經(jīng)保溫發(fā)酵30 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態(tài)氮含量先上升后緩慢降低，蛋白酶活力則迅速下降。0～8 d，該階段甜面醬中氨基酸態(tài)氮含量從0.39%上升為0.42%；8～68 d，氨基酸態(tài)氮含量由0.42%逐漸下降至0.4%。曬露階段，中性蛋白酶活力從27.22 U/g降低到3.24 U/g，酸性蛋白酶活力則由80.74 U/g減少為14.76 U/g。

由圖3中d可知，經(jīng)保溫發(fā)酵35 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態(tài)氮含量先上升后趨于穩(wěn)定，蛋白酶活力逐漸降低。0～14 d，醬醪中氨基酸態(tài)氮含量從0.39%增加為0.42%；曬露發(fā)酵14 d之后，醬醪中氨基酸態(tài)氮含量無顯著性差異(P>0.05);68 d，氨基態(tài)氮含量約為0.41%。曬露階段，中性蛋白酶活力由12.24 U/g降低到5.08 U/g，酸性蛋白酶活力則從78.04 U/g下降至18.99 U/g。

由圖3中e可知，經(jīng)保溫發(fā)酵40 d再進(jìn)行曬露發(fā)酵的甜面醬，在曬露過程中，醬醪中氨基酸態(tài)氮含量略微有增加后趨于穩(wěn)定，曬露發(fā)酵68 d，氨基酸態(tài)氮含量約為0.42%。隨著曬露時(shí)間的延長，醬醪中蛋白酶活力則逐漸降低，其中，中性蛋白酶活力從7.66 U/g降低到2.34 U/g，酸性蛋白酶由62.71 U/g下降至12.23 U/g。

圖3結(jié)果表明，甜面醬曬露階段氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升，后期有所下降，而蛋白酶活力在整個(gè)曬露過程中均逐漸減小。曬露初期，中性蛋白酶及酸性蛋白酶共同作用促使原料中未降解完全的蛋白質(zhì)繼續(xù)水解為氨基酸，使得氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升；曬露階段后期，氨基酸經(jīng)脫氨、脫羧反應(yīng)參與其他物質(zhì)生成使得含量有所下降，同時(shí)，蛋白酶活力雖降低但仍發(fā)揮催化作用，又促使氨基態(tài)氮含量上升，兩者共同作用維持曬露后期醬醪中氨基酸態(tài)氮含量略微下降至基本穩(wěn)定。曬露階段蛋白酶活力進(jìn)一步降低，其原因有：其一，經(jīng)過前期的保溫發(fā)酵，醬醪中pH值進(jìn)一步下降；其二，隨著發(fā)酵過程中水分含量降低，食鹽相對濃度增加，從而抑制酶活力。因酸性蛋白酶較中性蛋白酶所受影響小，整體而言，酸性蛋白酶活力要高于中性蛋白酶活力。甜面醬經(jīng)保溫發(fā)酵不同時(shí)間后，再進(jìn)行曬露發(fā)酵68 d，其中氨基酸態(tài)氮含量最高的為5號(hào)樣品，其含量約為0.42%；3號(hào)樣品的氨基酸態(tài)氮含量最低，約為0.4%；其余樣品中氨基酸態(tài)氮含量約為0.41%。整體而言，樣品間氨基酸態(tài)氮含量無顯著性差異(P>0.05)。

3.4 甜面醬曬露階段醬體感官變化情況

對保溫不同時(shí)間的甜面醬分別經(jīng)曬露成熟的樣品進(jìn)行感官評定，結(jié)果見表1。

表1 甜面醬曬露階段醬體的感官記錄Table 1 Sensory record of sweet soy bean paste during insotation and exposure stage

續(xù) 表

由表1可知，甜面醬在曬露發(fā)酵過程中，感官形態(tài)隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，曬露階段，醬醪色澤逐漸趨于成熟要求，滋味香氣互相協(xié)調(diào)，此階段主要為生香、成色的過程。結(jié)合3.1～3.3理化指標(biāo)的測定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10296-2009要求，分別保溫發(fā)酵20，25，30，35，40 d的甜面醬在經(jīng)曬露相同時(shí)間70 d左右后基本成熟，兩段式保溫發(fā)酵生產(chǎn)甜面醬的周期在3～4個(gè)月左右，比人工保溫發(fā)酵周期長1～2個(gè)月，但縮短自然曬露發(fā)酵周期8～9個(gè)月。

4 結(jié)論

保溫發(fā)酵不同時(shí)間的甜面醬，在曬露發(fā)酵相同時(shí)間70 d左右，醬醪理化指標(biāo)與感官形態(tài)基本符合標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10296-2009中對甜面醬達(dá)到成熟的要求。兩段式發(fā)酵生產(chǎn)甜面醬的周期在3～4個(gè)月左右，比自然曬露發(fā)酵的生產(chǎn)周期縮短8～9個(gè)月。

結(jié)合理化指標(biāo)與感官形態(tài)確定了甜面醬兩段式發(fā)酵的生產(chǎn)周期，后期研究將通過對比保溫發(fā)酵不同時(shí)間后經(jīng)曬露成熟的甜面醬成品質(zhì)量來進(jìn)一步確定最佳的保溫發(fā)酵時(shí)間。