米非司酮對耐奧拉帕尼卵巢上皮癌細(xì)胞生長與干性的抑制作用*

陳 麗，李 華，閆 怡，李柱娟，石 磊，柏 義，羅文婷

(重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院婦科， 重慶 江津 402260)

卵巢癌是女性死亡的重要原因。盡管在分子生物學(xué)、影像診斷學(xué)和多學(xué)科治療方面已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，但卵巢癌預(yù)后仍然很差[1]。多數(shù)卵巢癌患者在診斷時已是晚期，5年生存率小于50%[2-3]。奧拉帕尼(olaparib)是一種全新的口服多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]抑制劑，用于治療乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene,BRCA)突變相關(guān)的晚期卵巢癌[4]。但一些患者在使用奧拉帕尼后出現(xiàn)耐藥，從而導(dǎo)致治療失敗，奧拉帕尼耐藥的出現(xiàn)促使研究者尋找能夠挽救性治療耐奧拉帕尼卵巢癌的藥物[5]。米非司酮(mifepristone，MIFE)為孕激素及其受體拮抗劑，臨床上主要用于避孕、終止早孕和激素替代治療。有研究發(fā)現(xiàn)米非司酮可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可以在一定程度上殺傷卵巢癌耐藥細(xì)胞[6-7]。本研究旨在探索米非司酮對奧拉帕尼耐藥的卵巢上皮癌(ovarian epithelial cancer,OEC)細(xì)胞生長和干性的影響。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本來源

取本院婦科手術(shù)切除新鮮標(biāo)本5例。術(shù)后腫瘤組織病理檢查證實均為卵巢上皮癌?；颊吣挲g34～61歲，平均43.6歲。臨床分期：3例Ⅱ期，2例Ⅲ期。所有納入患者術(shù)前均未進(jìn)行過放化療等治療?；颊邥嫱獗狙芯?，并且本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 實驗試劑

膠原酶A、MCDB/M199培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；奧拉帕尼由北京科萊博公司合成；米非司酮購自Sigma；MTT試劑購自于江蘇碧云天公司；抗Ki-67抗體購自Santa Cruz；FITC標(biāo)記的II抗購自Molecular Probes；RNA提取TRIzol試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒購自TaKaRa；PE標(biāo)記的CD24和FITC標(biāo)記的抗CD44抗體購自BioLegend。

3 實驗方法

3.1原代細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將新鮮獲取的5例OEC組織在細(xì)胞間超凈工作臺清洗后，用剪去掉周圍壞死組織、血凝塊及脂肪組織等，分別移入無菌培養(yǎng)皿中，眼科剪剪碎至1 mm×1 mm×1 mm，每例樣本組織分成3等份至15 mL離心管中，各加入0.2 g/L膠原酶A溶液10 mL吹打均勻，轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫?fù)u床消化4 h，常溫3 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀部分用無菌PBS重懸，重復(fù)離心3次后，分別用含有100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素/鏈霉素的MCDB/M199培養(yǎng)基重懸，分別轉(zhuǎn)移至直徑3.5 cm培養(yǎng)皿中，并添加霍亂毒素(100 μg/L)、氫化可的松(15 mg/L)、胰島素(440 mg/L)及肝素(4 mg/L)等細(xì)胞生長因子，細(xì)胞孵箱(5% CO2，37 ℃)內(nèi)培養(yǎng)5 d后換液，多數(shù)卵巢癌細(xì)胞及少量成纖維細(xì)胞貼壁，之后根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基顏色及細(xì)胞生長情況每隔2～3 d換液，待細(xì)胞80%左右融合時，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。因成纖維細(xì)胞相比卵巢腫瘤細(xì)胞易脫落，采用差速消化法，在倒置顯微鏡下觀察，待成纖維細(xì)胞基本消化完成時，吸去上層液體，重新加入胰蛋白酶進(jìn)行消化后再培養(yǎng)。如此方法反復(fù)培養(yǎng)2次，將最終將消化后細(xì)胞稀釋至2×108/L，繼續(xù)分別傳代培養(yǎng)[8]。每例樣本組織獲得的OEC原代細(xì)胞分別標(biāo)記為OEC-Ⅰ、OEC-Ⅱ、OEC-Ⅲ、OEC-Ⅳ和OEC-Ⅴ。分別取4～8代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

3.2耐藥細(xì)胞構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)[9]報道的方法，每例樣本組織獲得的OEC細(xì)胞分別在連續(xù)遞增濃度的奧拉帕尼構(gòu)建配對匹配的耐奧拉帕尼OEC細(xì)胞(OEC/olaparib細(xì)胞)。從2 μmol/L奧拉帕尼為初始藥物濃度，并采用濃度遞增反復(fù)刺激的方法，最終逐漸增加至最終濃度12 μmol/L，以模擬每日口服400 mg奧拉帕尼的卵巢癌患者的典型穩(wěn)態(tài)血漿濃度[10]，最終使得細(xì)胞能耐受12 μmol/L奧拉帕尼。最終構(gòu)建的對應(yīng)原5例樣本組織獲得的OEC細(xì)胞的5組OEC/olaparib細(xì)胞，分別標(biāo)記為OEC-Ⅰ/olaparib、OEC-Ⅱ/olaparib、OEC-Ⅲ/olaparib、OEC-Ⅳ/olaparib和OEC-Ⅴ/olaparib。每組耐藥細(xì)胞于實驗前在含有6 μmol/L奧拉帕尼的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周。

3.3MTT實驗驗證OEC/olaparib細(xì)胞構(gòu)建的效果 按照文獻(xiàn)[11]界定藥物濃度范圍為0～200%(血漿藥物濃度峰值)，按照文獻(xiàn)[10]計算出奧拉帕尼的濃度范圍為0～40 μmol/L。5例組織樣本來源的OEC細(xì)胞和與之配對匹配的OEC/olaparib細(xì)胞接種于96孔板(每孔5 000個)中，并分別用(0、10、20、30和40 μmol/L)奧拉帕尼在5% CO2、37 ℃下處理OEC/olaparib細(xì)胞48 h，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。將所得的甲臜晶體溶解在DMSO中，在570 nm下進(jìn)行定量分光光度測定細(xì)胞活力，并使用GraphPad Prism 6軟件制作細(xì)胞生存曲線。

3.4MTT實驗檢測體外米非司酮對OEC/olaparib細(xì)胞活力的影響 為評價米非司酮的劑量反應(yīng)效應(yīng)，分別取構(gòu)建的5組OEC/olaparib細(xì)胞用不同劑量[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]的米非司酮處理48 h。然后采用MTT法檢測細(xì)胞的活力。

3.5集落形成實驗 取構(gòu)建的OEC-Ⅱ/olaparib細(xì)胞接種在6孔板中(每孔1 000個細(xì)胞)，用不同劑量的[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]米非司酮處理48 h，然后更換不含米非司酮的培養(yǎng)基。培養(yǎng)10 d后，用4%PFA固定細(xì)胞，然后用0.1%結(jié)晶紫染色。計算可見集落的數(shù)量。

3.6流式細(xì)胞術(shù) 取構(gòu)建的OEC-Ⅱ/olaparib細(xì)胞接種在6孔板中，用不同劑量的[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]米非司酮處理48 h后，收集OEC/olaparib細(xì)胞，并用抗CD24(PE標(biāo)記)，抗CD44(FITC標(biāo)記)或相應(yīng)的同型對照抗體在4 ℃孵育30 min，然后使用流式細(xì)胞術(shù)分析。

3.7RNA提取與RT-qPCR 取構(gòu)建的OEC-Ⅱ/olaparib細(xì)胞接種在6孔板中，用不同劑量的[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]米非司酮處理48 h后，收集OEC/olaparib細(xì)胞，利用TRIzol法從細(xì)胞中提取總RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR? Premix Ex TaqTMII Kit進(jìn)行實時定量PCR實驗。CD24正向引物序列為5’-TGAAGAACATGTGAGAGGTTTGAC-3’，反向引物序列為5’-GAAAACTGAA TCTCCATTCCACAA-3’；CD44的正向引物序列為5’-ACCTCTCATTACCCAC ACACG-3’，反向引物序列為5’-TGACTTTTTCTTCTGCCCACA-3’； CD133的正向引物序列為5’-TGGGGCTGCTGTTTATTATTAT-3’，反向引物序列為5’-AACCATAGAAGATGCCAATGCT-3’； GAPDH的正向引物序列為5’-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3’，反向引物序列為5’-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3’。以GAPDH作為內(nèi)參照。結(jié)果采用2-ΔΔCt算法來計算。

3.8裸鼠成瘤實驗 6周齡的雌性BALB/c裸鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(渝) 2018-0003]，在SPF級動物房飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行構(gòu)建卵巢癌異位移植瘤。取構(gòu)建的OEC-Ⅱ/olaparib細(xì)胞將單細(xì)胞懸浮液(100 μL PBS中含有1×107個細(xì)胞)注射到裸鼠體內(nèi)皮下。當(dāng)腫瘤生長到100～200 mm3時，將小鼠隨機(jī)分為對照組和5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg米非司酮治療組，每組5只。米非司酮的劑量與治療方法結(jié)合文獻(xiàn)[12-13]并稍作修改，治療組裸鼠分別腹腔注射5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg的米非司酮(溶劑為0.01%乙醇)，對照組注射相同體積的溶劑；每天治療2次，持續(xù)14 d。每2 d測量腫瘤體積1次，計算公式為：體積=長度×寬度2/2。在30 d實驗結(jié)束時，麻醉小鼠稱重，取異位移植瘤組織稱重，福爾馬林固定，石蠟包埋，準(zhǔn)備免疫組化染色。

3.9免疫組化染色 將切片在二甲苯中脫蠟，使用梯度乙醇脫水，然后在0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中用高壓釜煮沸20 min。用0.3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物活性，并用正常山羊血清孵育切片，以減少非特異性結(jié)合。組織切片用抗Ki-67抗體(1 ∶500)在4 ℃下孵育過夜。免疫組化EnVision二步染色法參照試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS代替 I 抗作為陰性對照。組織抗原修復(fù)均采用高溫高壓修復(fù)處理，最終在光學(xué)顯微鏡下成像。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組定量資料的比較采用單因素方差分析方法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 建立耐奧拉帕尼細(xì)胞

選擇不同濃度的奧拉帕尼處理5組OEC細(xì)胞和構(gòu)建的5組OEC/olaparib細(xì)胞48 h，MTT實驗檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示5組OEC/olaparib細(xì)胞對奧拉帕尼的敏感性顯著低于匹配的OEC細(xì)胞(P<0.01),見圖1。以上數(shù)據(jù)說明，我們成功建立了耐奧拉帕尼細(xì)胞OEC/olaparib。

Figure 1. The viability of OEC cells and OEC/olaparib cells with olapanib treatment was measured by MTT assay. A: OEC-Ⅰ and OEC-Ⅰ/olaparib cells; B: OEC-Ⅱ and OEC-Ⅱ/olaparib cells; C: OEC-Ⅲ and OEC-Ⅲ/olaparib cells; D: OEC-Ⅳ and OEC-Ⅳ/olaparib cells; E: OEC-Ⅴ and OEC-Ⅴ/olaparib cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsOEC/olaparib cells.
圖1 MTT法檢測OEC細(xì)胞和OEC/olaparib細(xì)胞在奧拉帕尼處理下細(xì)胞活力的變化

2 米非司酮抑制OEC/olaparib細(xì)胞的活力

采用不同濃度的米非司酮處理5組OEC/olaparib細(xì)胞48 h，MTT實驗檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，米非司酮能濃度依賴性抑制OEC/olaparib細(xì)胞活力(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

Figure 2. Mifepristone (MIFE) inhibited the viability of OEC/olaparib cellsinvitroin a dose-dependent manner. A: OEC-Ⅰ and OEC-Ⅰ/olaparib cells; B: OEC-Ⅱ and OEC-Ⅱ/olaparib cells; C: OEC-Ⅲ and OEC-Ⅲ/olaparib cells; D: OEC-Ⅳ and OEC-Ⅳ/olaparib cells; E: OEC-Ⅴ and OEC-Ⅴ/olaparib cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.
圖2 米非司酮呈劑量依賴性抑制OEC/olaparib細(xì)胞的活力

3 米非司酮抑制OEC/olaparib細(xì)胞集落數(shù)

集落形成實驗的結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，用米非司酮處理的OEC/olaparib細(xì)胞形成的集落數(shù)顯著減少(P<0.05或P<0.01)，且米非司酮對OEC/olaparib細(xì)胞集落形成的抑制作用呈劑量依賴性，其中10 μmol/L米非司酮組的抑制作用最顯著(P<0.01)，見圖3A。由亮視野顯微鏡圖像可見，經(jīng)10 μmol/L米非司酮處理的OEC/olaparib細(xì)胞顯示出較差的生存能力,見圖3B。

Figure 3. Mifepristone (MIFE) inhibited the growth of OEC/olaparib cellsinvitroin a dose-dependent manner. A: the representative images of cell colony after treatment with different doses of mifepristone and the quantitative analysis of the number of colonies; B: bright field microscopic images (the scale bar=1 mm) taken by inverted microscope after treatment with different doses of mifepristone. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.
圖3 米非司酮呈劑量依賴性抑制OEC/olaparib細(xì)胞生長

4 米非司酮抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞的干性

通過測量OEC/olaparib細(xì)胞中3種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD24、CD44和CD133的表達(dá)來評估OEC/olaparib細(xì)胞的干性。RT-qPCR結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，米非司酮治療組這3個標(biāo)志物的表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，經(jīng)10 μmol/L米非司酮處理的治療組干細(xì)胞標(biāo)志物的下調(diào)最為顯著(P<0.01)，見圖4A，說明米非司酮對干細(xì)胞標(biāo)志物的下調(diào)效應(yīng)呈劑量依賴性。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測OEC/olaparib細(xì)胞中CD24和CD44的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示 10 μmol/L米非司酮處理顯著降低了CD24+、CD44+和CD24+/CD44+細(xì)胞亞群的數(shù)量(P<0.01)，見圖4B～D。以上結(jié)果說明，米非司酮對卵巢癌耐藥細(xì)胞的干性有抑制作用。

Figure 4. Mifepristone (MIFE) reduced the stemness of OEC/olaparib cells. A: relative mRNA levels of cancer stem cell markers CD24, CD44 and CD133 in the OEC/olaparib cells after MIFE treatment; B: MIFE reduced CD24 protein expression of in the OEC/olaparib cells; C: MIFE reduced the protein expression of CD44 in the OEC/olaparib cells; D: MIFE reduced the population of CD24+/CD44+OEC/olaparib cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.
圖4 米非司酮抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞的干性

5 米非司酮抑制OEC/olaparib細(xì)胞在體內(nèi)的生長

裸鼠異位移植瘤實驗的結(jié)果顯示，在實驗結(jié)束時，各組小鼠體重的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖5A；而米非司酮治療組裸鼠腫瘤的大小、重量和體積明顯小于溶媒對照組(P<0.01或P<0.01)，經(jīng)20 mg/kg米非司酮處理組的腫瘤大小、重量和體積降低最為顯著(P<0.01)，見圖5B、C。對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色以檢測Ki-67的表達(dá)，統(tǒng)計結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，20 mg/kg米非司酮治療組的腫瘤組織中Ki-67蛋白的表達(dá)較低(P<0.01)，見圖5D。以上數(shù)據(jù)說明，米非司酮呈劑量依賴性地降低了OEC/olaparib細(xì)胞在體內(nèi)的生長能力。

Figure 5. Mifepristone (MIFE) inhibited OEC/olaparib cell growth in nude mice xenografts. A: at the end of the experiment, the body weight of each group of the mice was calculated; B: photographs and weight of xenograft tumors in each group; C: statistical results of the tumor volume in each group during 30 d; D: representative images and statistical results of Ki-67 staining of xenograft tumors in 20 mg/kg MIFE treatment group and vehicle group. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsvehicle group.
圖5 米非司酮抑制裸鼠移植瘤OEC/olaparib細(xì)胞生長的觀察

討 論

卵巢癌是常見的婦科腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，在我國卵巢癌發(fā)病率居婦科腫瘤第4位，死亡率居第3位[14]。復(fù)發(fā)和耐藥是卵巢癌晚期患者預(yù)后不良的主要原因。晚期卵巢癌治療策略的改進(jìn)是亟待解決的問題。

奧拉帕尼(商品名TynparzaTM，原名AZD2281)是一種全新的口服PARP強(qiáng)抑制劑，于2014年被FDA和EMA批準(zhǔn)為一類用于治療BRCA基因突變相關(guān)的晚期卵巢癌的PARP抑制劑[15]。而一些卵巢癌患者經(jīng)一段時間奧拉帕尼治療后，會出現(xiàn)耐藥。針對PARP抑制劑耐藥性原因的研究表明，在大多數(shù)情況下，這種耐藥性的機(jī)制是未知的，另外約有15%的BRCA突變逆轉(zhuǎn)以及10%的TP53BP1基因突變所致[16]。

米非司酮是一種作用于受體水平的孕激素拮抗劑，兼有抗糖皮質(zhì)激素的作用，臨床上主要用于終止早孕、緊急避孕和引產(chǎn)等。利用其抗孕激素活性治療子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥和異位妊娠等也獲得成功。研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮可抑制卵巢癌上皮細(xì)胞的生長，對于化療耐藥性卵巢癌也具有一定的療效[13, 17-18]。而米非司酮對奧拉帕尼耐藥的卵巢癌作用如何尚不清楚。本研究采用膠原酶A酶解組織塊法進(jìn)行上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)，并添加不同細(xì)胞生長促進(jìn)因子，可獲得活性較高、數(shù)量較多的原代細(xì)胞[19]。進(jìn)行體外原代細(xì)胞培養(yǎng)是研究上皮性卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及對藥物反應(yīng)的重要途徑[20]。相比細(xì)胞系，原代培養(yǎng)細(xì)胞更加接近人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞特性，更適宜用于實驗研究及指導(dǎo)臨床治療。本研究采用卵巢上皮癌原代細(xì)胞，成功建立了奧拉帕尼耐藥的衍生細(xì)胞系，探討米非司酮對奧拉帕尼耐藥的卵巢上皮癌細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示米非司酮在體內(nèi)外可以抑制奧拉帕尼耐藥細(xì)胞的生長，并且這種作用呈劑量依賴性，其抑制作用可能與下調(diào)耐藥細(xì)胞的干性相關(guān)。另外，多項研究報道了奧拉帕尼與順鉑、卡鉑和環(huán)磷酰胺等DNA損傷劑的協(xié)同作用[21-22]。因此，奧拉帕尼與其他化療藥物的聯(lián)合治療腫瘤可能是一個有希望的治療手段，是否可以通過奧拉帕尼和米非司酮聯(lián)合用藥，延長晚期卵巢癌患者的總生存，也是未來值得研究的方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)米非司酮可以在體內(nèi)外抑制奧拉帕尼耐藥卵巢上皮癌細(xì)胞的生長和干性。本研究對米非司酮用于奧拉帕尼耐藥卵巢癌的治療提供了一個理論參考依據(jù)。