多重耐藥性雞白痢沙門菌的分離鑒定及敏感噬菌體的篩選

張玲 李相安 程曉薇 鄒本革 聶凡皓 鄭剛 牟思洋 聶凡淇 姜雪萍

摘? 要：本研究對濰坊某種雞場死胚進(jìn)行病原菌分離鑒定，并從該種雞場孵化室污水中篩選對其敏感的噬菌體。結(jié)果顯示：病原菌為雞白痢沙門菌，命名為WF-1，且呈現(xiàn)多重耐藥性。利用從該孵化室污水中分離到的噬菌體WFSp1及實(shí)驗(yàn)室分離保存的5株（Sp1、Sp2、Sp3、Sp4和Sp5）沙門菌噬菌體對其進(jìn)行敏感性測定，發(fā)現(xiàn)噬菌體WFSp1對其敏感性最高。體外裂解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噬菌體WFSp1在160 min內(nèi)可完全裂解WF-1分離株，裂解增殖后的噬菌體效價(jià)高達(dá)2.5×1011 PFU/mL。該研究結(jié)果為用噬菌體制劑控制雞沙門菌感染提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：多重耐藥性;雞白痢沙門菌;分離鑒定;敏感噬菌體

中圖分類號：S831.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2020）12-0073-07

沙門菌引起的雞白痢是雞場常見的細(xì)菌性疾病，可經(jīng)種蛋垂直傳播，被污染的種蛋孵化率下降，或孵出帶菌雛雞，并成為雞場主要傳染源[1]。沙門菌還可通過被污染的飼料、飲水、墊料、糞便、老鼠和環(huán)境等水平傳播[2-3]。種雞場在臨床治療雞白痢時，如果盲目用藥，會加劇雞白痢沙門菌的耐藥性，進(jìn)而會給養(yǎng)雞業(yè)造成重大危害和經(jīng)濟(jì)損失。

噬菌體是生物界中數(shù)量最大的生物群體，也是目前已知的最大病毒群。在自然界，噬菌體的數(shù)量估計(jì)超過1030～1032個，被稱為生物界的“暗物質(zhì)”，是地球上最豐富的生命體[4-5]。噬菌體可以特異、高效地殺滅細(xì)菌，與抗生素相比，能大大地減少對微生物群體自然多樣性的破壞。因此，近年來噬菌體作為新型抗菌劑得到廣泛的研究，由此產(chǎn)生的產(chǎn)品層出不窮，遍及臨床醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、土壤改良等多個領(lǐng)域[6-7]。本研究從山東省濰坊市某種雞場孵化室的死胚中分離到一株多重耐藥性的雞白痢沙門菌，并測定其對噬菌體的敏感性，以期為種雞場利用噬菌體控制雞白痢提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1 樣本來源

細(xì)菌分離樣本來自濰坊和煙臺地區(qū)種雞場孵化室的死胚;分離噬菌體的樣本來自該孵化場的污水;雞白痢沙門菌陽性菌株YN-1由本實(shí)驗(yàn)室鑒定后保存。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

微量生化發(fā)酵管和藥敏試紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;PCR試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，胰蛋白酶、酵母提取物（OXOID公司），瓊脂干粉（日本BOSHARP公司），SS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），SM緩沖液、LB半固體培養(yǎng)基和雙層瓊脂培養(yǎng)基等由本實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），Centrifuge 5810R臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），SHAKE SCS-24恒溫?fù)u床（上海市離心機(jī)械研究所有限公司），0.22 μm濾器（法國Millipore公司）。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

無菌操作解剖雞胚，蘸取卵黃液接種到SS培養(yǎng)基上劃線分離，37 ℃下倒置培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況，挑選典型菌落，進(jìn)行細(xì)菌純化，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鏡檢

挑取SS培養(yǎng)基上純化的單個菌落， 37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，得到新鮮對數(shù)期菌液，涂布于載玻片上，干燥固定后進(jìn)行革蘭染色和鞭毛染色，鏡檢觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.5 細(xì)菌的生化鑒定

將初步鑒定為沙門菌的菌株劃線接種于SS培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)18 h～24 h，取菌落加入到生理鹽水中制成均勻懸液，比濁度在0.5～0.65個麥?zhǔn)蠁挝?。將制備好的?xì)菌懸液接種于各種生化反應(yīng)管中，37 ℃下培養(yǎng)24 h～48 h。根據(jù)生化管說明書記錄試驗(yàn)結(jié)果。參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB4789.4-2016）判斷結(jié)果。

1.6 細(xì)菌的PCR鑒定

取細(xì)菌菌液提取DNA，利用雞白痢沙門菌特異性引物對疑似沙門菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。以雞白痢沙門菌rfbS基因在第237位和第598位堿基的差異，設(shè)計(jì)特異性PCR引物。上游引物：5-TGCCTATCAGAGTATTAGTGT-3，下游引物：5-TATTCACGAATTGATATATCCT-3。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃，10 min;94 ℃ 30s，50 ℃ 30s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán);72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 細(xì)菌的耐藥性分析

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）[臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI），2011]，根據(jù)CLSI推薦方法進(jìn)行操作，在無菌條件下，吸取0.2 mL滴度為5×108 CFU/mL 經(jīng)鑒定的沙門菌菌液，滴入LB瓊脂平皿中，涂布均勻，以保證細(xì)菌在平皿表面均勻分布，蓋上皿蓋，室溫下放置3 min～5 min，使培養(yǎng)基表面的水分吸收掉，用無菌鑷子將10種藥敏紙片貼于平皿中，37 ℃下培養(yǎng)18 h～24 h，測量抑菌圈的直徑。根據(jù)CLSI（2011）標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感（S）、中介（I）和耐藥（R），分析病原菌的耐藥譜。

1.8 細(xì)菌噬菌體的篩選

以雞白痢沙門菌分離株為宿主菌，挑取復(fù)蘇的單菌落，制備細(xì)菌懸液備用。取細(xì)菌分離相應(yīng)的孵化場的污水放入雞白痢沙門菌懸液各500 μL，混勻后37 ℃下浸泡6 h，用無菌紗布濾去多余雜質(zhì)，經(jīng)10 000 r/min離心15 min，將上清經(jīng)0.22 μm濾器過濾。取200 μL濾液與200 μL對數(shù)期的宿主菌混勻，37 ℃下孵育5 min，混合液與5 mL上層瓊脂培養(yǎng)基充分混勻后迅速鋪到瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)3 h～4 h，觀察有無噬菌斑出現(xiàn)。

摳取噬菌斑于盛有1 mL生理鹽水的EP管中，40 ℃水浴30 min。浸出液10 000 r/min離心5 min，將上清用LB肉湯進(jìn)行10倍稀釋至合適的稀釋度，雙層平板法得到單個噬菌斑。重復(fù)3～5次直至獲得大小和形態(tài)一致的噬菌斑。

1.9 細(xì)菌噬菌體的效價(jià)測定

將100 μL培養(yǎng)好的噬菌體液進(jìn)行不同梯度的稀釋，稀釋到合適濃度后將200 μL噬菌體與200 μL的宿主菌混勻，37 ℃下孵育5 min。將上述混合液加入50 ℃左右的上層中，混合均勻倒入下層平板中。待上層凝固后倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h～6 h后，記錄噬菌斑數(shù)量，計(jì)算噬菌體效價(jià)。

1.10 噬菌體對分離菌株的體外裂解作用

選取敏感噬菌體WFSp1進(jìn)行體外裂解測定。分別吸取200 μL噬菌體增殖液和細(xì)菌懸液（銀杏對照組加200 μL菌液和? ?200 μL LB肉湯），于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中180 r/min 37 ℃下振蕩培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基渾濁情況，并每隔20 min檢測培養(yǎng)液的OD600 nm變化，并通過雙層平板法檢測噬菌體增殖液的效價(jià)。

1.11 噬菌體WFSp1的形態(tài)觀察

將滴度為2.5×1011 PFU/mL的噬菌體純化液滴到覆有Foumovar膜的銅網(wǎng)上， 10 min～15 min后濾紙吸去余液，再滴加一滴2%的磷鎢酸負(fù)染5 min～10 min，濾紙吸去余液，室溫晾干，JEM-1011透射電鏡下觀察并拍照。

2? 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果

從濰坊市某種雞場孵化室的死胚中分離到1株細(xì)菌，命名為WF-1。在SS培養(yǎng)基上得到形態(tài)邊緣整齊，稍隆起，表面光滑濕潤，有金屬光澤的黑色菌落，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，結(jié)果見圖1。鏡檢結(jié)果為革蘭陰性，單個或成對排列，粗短、兩端鈍圓的小桿菌（比大腸桿菌細(xì)），結(jié)果見圖2。經(jīng)過鞭毛染色后，鏡檢觀察到細(xì)長成束的鞭毛，結(jié)果見圖3。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

將SS培養(yǎng)基上分離到的典型或可疑菌落分別接種至營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純培養(yǎng)，然后分別接種于三糖鐵瓊脂（TSI）斜面和HBI沙門菌生化鑒定條進(jìn)行培養(yǎng)。通過試驗(yàn)鑒定，初步認(rèn)為WF-1為沙門菌，具體結(jié)果見表1。

2.3 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果

以分離株WF-1的細(xì)菌基因組DNA為模板，利用雞白痢沙門菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期400 bp大小一致的片段，確定分離菌株WF-1為雞白痢沙門菌，結(jié)果見圖4。

2.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2列出了雞白痢分離株WF-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，與沙門菌對照株YN-1相比，分離株WF-1對臨床常用抗生素氟苯尼考、阿奇霉素、大觀霉素、林可霉素、阿莫西林、多西環(huán)素和新霉素均產(chǎn)生耐藥性。

2.5 細(xì)菌噬菌體的篩選純化

以雞白痢沙門菌WF-1為宿主菌進(jìn)行噬菌體篩選。挑取噬菌斑，經(jīng)過4代分離純化后，噬菌體在雙層平板上形成直徑5 mm左右、規(guī)則透明的噬菌斑，并伴有暈圈，結(jié)果見圖5。

2.6 噬菌體效價(jià)的測定

將Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Sp5和WFSp1共6株噬菌體裂解液進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用雙層瓊脂平板法將噬菌體培養(yǎng)12 h，在平板上均形成形態(tài)規(guī)則、大小一致的噬菌斑，從中選取噬菌斑數(shù)在30～300個的平板，計(jì)算噬菌體的效價(jià)，并記錄結(jié)果，結(jié)果見表3。

2.7 噬菌體WFSp1對WF-1分離株的體外裂解分析

將分離的噬菌體WFSp1和WF-1混合，振蕩培養(yǎng)160 min后，發(fā)現(xiàn)噬菌體和細(xì)菌混合的培養(yǎng)基液體變清亮，搖動可見細(xì)微的細(xì)菌碎片，對照組培養(yǎng)基液體渾濁。噬菌體WFSp1對WF-1的體外裂解OD600 nm結(jié)果見圖6。OD600 nm變化顯示，兩組混合液中0～ 100 min細(xì)菌濃度不斷增高，100 min～? ? 140 min WFSp1+WF-1組菌液濃度開始下降，140 min～160 min WFSp1+WF-1組菌液濃度接近0，同時陰性對照組菌液濃度持續(xù)增高。由此可知WF-1被噬菌體WFSp1于? 160 min內(nèi)完全裂解，測得增殖后噬菌體的效價(jià)為2.5×1011 PFU/mL。

2.8 噬菌體WFSp1的形態(tài)觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)噬菌體WFSp1屬于有尾噬菌體目短尾病毒科，二十面體結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖7。

3? 討論

雞白痢沙門菌引起的傳染性疾病可水平傳播和垂直傳播，并且可在雞群中持續(xù)循環(huán)感染。種雞感染后，雞場若不及時采取措施，不僅會影響種雞生產(chǎn)，還會影響種蛋的孵化率，提高雛雞的病死率，給養(yǎng)雞業(yè)帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。很多發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，如西歐、美國、加拿大、澳大利亞和日本，已經(jīng)實(shí)施并完成了雞白痢的凈化工作，但是在發(fā)展中國家，雞白痢仍然流行和蔓延。雞白痢沙門菌對抗菌藥耐藥性日益嚴(yán)重，隨著耐藥范圍擴(kuò)大和耐藥水平增高已成為影響全球公共衛(wèi)生安全的重要問題[11-13]。噬菌體特異性強(qiáng)，能自我復(fù)制，專一性強(qiáng)，源于自然，對環(huán)境及動物機(jī)體友好，具有殺死耐藥性細(xì)菌的功能，已有報(bào)道用噬菌體在臨床上治療耐藥性細(xì)菌感染[4-5，10]。噬菌體將在禁抗、限抗、無抗的政策中發(fā)揮防治細(xì)菌性疾病的獨(dú)特優(yōu)勢，目前普遍認(rèn)為其是一種作為新型替代抗生素的生物制劑。

4? 結(jié)論

本研究針對從濰坊市某種雞場分離到的雞白痢沙門菌進(jìn)行自場噬菌體篩選，并測定其對分離噬菌體的敏感性，體外裂解試驗(yàn)顯示噬菌體WFSp1在160 min內(nèi)可以完全裂解雞白痢沙門菌WF-1，且裂解后噬菌體WFSp1效價(jià)高達(dá)2.5×1011 PFU/mL。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)FSp1對WF-1的裂解效果敏感高效，在臨床應(yīng)用中是否能發(fā)揮同樣的作用需要進(jìn)一步細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u估。在沙門菌耐藥性日益嚴(yán)重的情況下，期望噬菌體療法能夠在沙門菌的防控中發(fā)揮積極作用。

參考文獻(xiàn)

[1] ARORA D，KUMAR S，JINDAL N，et al. Prevalence and epidemiology of Salmonella enterica serovar Gallinarum from poultry in some parts of Haryana，India[J]. Vet World，2015，8（11）：1300-1304.

[2] GUPTA S，JINDAL N，KHOKHAR R S，et al. Individual and combined effects of ochratoxin A and Salmonella enterica serovar Gallinarum infection on pathological changes in broiler chickens[J]. Avian Pathol，2008，37（3）：265-272.

[3] ATLAS R，MALOY S. One Health and Food-Borne Disease[M]. Washington D C：ASM Press，2014：137-148

[4] ROHWER F，SEGALL A M. In retrospect：a century of phage lessons[J]. Nature，2015，528：46–48.

[5] WTTZANY G. Viruses： Essential Agents of Life[M]. Dordrecht：Springer，2012：61-81

[6] SALMOND G P，F(xiàn)INERAN P C. A century of the phage：past，present and future[J]. Nat Rev Microbiol，2015，13（12）：777-786.

[7] KORTRIGHT K E，CHAN B K，KOFF J L，et al. Phage therapy：a renewed approach to combat antibiotic-resistant bacteria[J]. Cell Host Microbe，2019，25（2）：219-232.

[8] HAJAM I A，KIM J，LEE J H. Oral immunization with a novel attenuated Salmonella Gallinarum encoding infectious bronchitis virus spike protein induces protective immune responses against fowl typhoid and infectious bronchitis in chickens[J]. Vet Res，2018，49（1）：91.

[9] AHIWALE S S，BANKAR A V，TAGUNDE S N，et al. Isolation and characterization of a rare waterborne lytic phage of Salmonella enterica serovar Paratyphi B[J]. Can J Microbiol，2013，59（5）：318-323.

[10] AHMADI M，KARIMI TORSHIZI M A，RAHIMI S，et al. Prophylactic bacteriophage administration more effective than post-infection administration in reducing Salmonella enterica serovar enteritidis shedding in quail[J]. Front Microbiol，2016，7：1253.

[11] BISWAS S，BRUNEL J M，DUBUS J C，et al. Colistin：an update on the antibiotic of the 21st century[J]. Expert Rev Anti Infect Ther，2012，10（8）：917-934.

[12] 劉志科，楊寧寧，徐錦鳳，等.雞白痢沙門菌病原的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（9）：2792-2800.

[13] 周盼伊. 《全國遏制動物源細(xì)菌耐藥行動計(jì)劃（2017-2020年）》提出六大行動[J]. 中國動物保健，2017，19（10）：2-3.