• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    1 株圓環(huán)病毒3 型美國毒株全基因組克隆與遺傳演化分析

    2022-01-13 06:29:10郝桂英陳瑛琪陳孝宇
    中國動物檢疫 2022年1期
    關(guān)鍵詞:核苷酸毒株基因組

    鄭 晶,郝桂英,謝 禮,安 微,楊 苗,陳瑛琪,張 婧,鄭 巧,陳 溪,陳孝宇,林 華

    (1.成都海關(guān)技術(shù)中心,四川省食品安全檢測重點實驗室,四川成都 610041;2.西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,四川西昌 615013;3.大連海關(guān)技術(shù)中心,遼寧大連 116014;4.武漢海關(guān)技術(shù)中心,湖北武漢 430010)

    豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是一種小型、無囊膜、單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA 病毒[1],屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬[2],是已知最小的病毒之一。該病毒能在豬和其他動物中引起廣泛疾病[3-4]。目前在已有報道中,根據(jù)抗原性和基因型的不同,其可分為PCV1[5]、PCV2[6]、PCV3[7]和PCV4[8]3 個血清型。PCV3 可引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。PCV3 感染后,患病母豬受孕率降低,流產(chǎn)率增加,可出現(xiàn)產(chǎn)死胎或木乃伊胎現(xiàn)象;患病仔豬出現(xiàn)多器官系統(tǒng)功能紊亂[9]。2016 年美國首次報道發(fā)現(xiàn)PCV3,隨后波蘭[10]、韓國[11]、中國[12]及意大利[13]等國家也相繼報道。PCV3 在世界范圍內(nèi)迅速擴散,引起了各國高度重視和密切關(guān)注。

    PCV3 全基因組長度約2 000 bp,包含11 個可能的開放閱讀框(ORF1—ORF11)。其中有3 個主要的開放閱讀框:ORF1 編碼由297 個氨基酸(aa)組成的復(fù)制酶蛋白Rep,ORF2 編碼由214 個aa 組成的衣殼蛋白Cap,ORF3 編碼由231 個aa 組成的功能未知蛋白質(zhì)[7]。目前,國際上尚無普遍公認(rèn)的PCV3 亞型分類規(guī)則。大部分學(xué)者根據(jù)基因組DNA全長序列差異,將PCV3分為兩個亞型(PCV3a和PCV3b)[14];也有學(xué)者根據(jù)Cap 蛋白存在的兩個氨基酸突變(A24V 和R27K)不同,將PCV3分為3 個亞型(PCV3a、PCV3b 和PCV3c)[15-16]。根據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)報道,中國[17]、印度[18]、越南[19]、泰國[20]及美國[14]等主要流行PCV3a、PCV3b 兩個亞型,其他國家或地區(qū)對PCV3 不同亞型的流行情況鮮有報道。本研究通過對染病的美國種豬采集組織樣品進行多種病原核酸擴增,確認(rèn)病料組織PCV3 陽性,然后擴增PCV3 全基因組,并將其與GenBank 上不同地區(qū)PCV3 參考毒株全基因組序列進行遺傳進化比對分析,根據(jù)基因組差異進行分型,以期了解該序列與不同地區(qū)PCV3 毒株的遺傳進化關(guān)系,為PCV3 分子流行病學(xué)研究及防控提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 樣品 2021 年4 月,四川省某企業(yè)進口美國種豬中發(fā)現(xiàn)疑似染疫豬,臨床表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白。對死亡豬采集肺臟、脾臟、淋巴結(jié)及小腸等組織樣品,放置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 主要試劑 MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取試劑盒,購自賽默飛世爾科技公司;2×HotStartTaqplus Master Mix(Quick Load)、ddH2O,購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;大腸桿菌DH5α、pMD18-T 載體、DL5 000 DNA Marker、DNA 膠回收試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司;氨芐青霉素(ampicillin)、Trans2K DNA Marker、6×loading buffer,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;胰蛋白胨(tryptone)和酵母提取物(Yeast Extract),購自英國Oxoid公司;氯化鈉、氫氧化鈉、瓊脂糖(agarose),購自西班牙BIOWEST 公司。

    1.1.3 引物設(shè)計與合成 參考GenBank 中收錄的PCV3 美國株(GenBank 登錄號:MK496297.1)全基因組序列,分別設(shè)計合成用于擴增PCV3 全基因組的2 對引物(表1)。引物由擎科生物(成都)科技有限公司合成。

    表1 引物序列

    1.2 樣品處理及RNA/DNA 提取

    無菌條件下將采集的病死豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織研磨攪碎,按照MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取試劑盒說明書,從病料組織中提取基因組。

    1.3 病原檢測

    按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[21-30]對病死豬組織分別進行豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬Delta 冠狀病毒(PDCoV)、塞內(nèi)卡病毒(SVV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬勞森氏胞內(nèi)菌(PPE)、豬支原體肺炎(M.HYO)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、PCV2及PCV3檢測。

    1.4 PCV3 基因組擴增

    以檢出PCV3 陽性的組織DNA 為模板,用已設(shè)計的2 對引物分別進行PCV3 基因組序列擴增。反應(yīng)體系為25.0 μL:2×TaqMaster Mix 12.5 μL、模板DNA 2.0 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,28 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。取5.0 μL 擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

    使用DNA 回收試劑盒對與預(yù)期大小相符的2條片段進行膠回收,并分別與pMD18-T 載體4 ℃連接過夜;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞,取100 μL 均勻涂布至含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12~16 h;挑選單個陽性克隆菌落接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h,進行菌液PCR 鑒定。

    1.5 PCV3 全基因組核苷酸序列比對與遺傳進化分析

    使用質(zhì)粒提取試劑盒對陽性克隆菌液提取質(zhì)粒,將酶切(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)正確的重組質(zhì)粒送擎科生物(成都)科技有限公司測序;對擴增產(chǎn)物大小約1 200 和1 100 bp 的核苷酸序列進行拼接,獲得PCV3 全基因組序列,并與國內(nèi)外38 個PCV3 參考毒株(表2)通過BLAST 在線進行核苷酸同源性比對;同時,用生物信息學(xué)軟件進行遺傳進化分析,采用Neighbor-Joining(NJ)法(1 000 次重復(fù)bootstrap 分析)生成系統(tǒng)進化樹。

    表2 PCV3 參考毒株全基因組序列信息

    1.6 PCV3 毒株ORF1、ORF2 核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

    用生物信息學(xué)軟件分別將獲得的美國毒株P(guān)CV3 ORF1 和ORF2 基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外38 個毒株進行比對分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病原檢測

    對病死豬組織分別進行PPV等9種病原檢測,結(jié)果顯示,僅檢出PCV3 陽性。

    2.2 PCV3 全基因組擴增

    將PCV3 全基因組擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,分別在約1 200 和1 100 bp 處出現(xiàn)擴增條帶,其大小與預(yù)期基本相符(圖1)。通過測序拼接后,獲得全長約為2 000 bp 的PCV3 全基因組序列。

    2.3 PCV3 毒株全基因組核苷酸序列比對與遺傳進化分析

    將獲得的PCV3 美國毒株命名為PCV3_USA2021(Genbank 登錄號:OL799306)。其與國內(nèi)外38 個毒株核苷酸同源性和遺傳進化分析結(jié)果顯示,PCV3_USA2021 全基因組核苷酸序列與38 個參考毒株序列同源性為98.7%~99.8%,其中,PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)、巴西毒株(255_18_42)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)等6 個毒株全基因組序列同源性最高,與俄羅斯毒株(PCV3-RU/SM17)和中國安徽毒株(PCV3/CN/Anhui-14/201611)同源性最低。

    遺傳進化關(guān)系分析結(jié)果(圖2)顯示,PCV3_USA2021 毒株與美國毒株(PCV3-US_SD2016)形成一個小的分支,與中國云南毒株(YN1-2017)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國江西毒株(PCV3_CN_Jiangxi-62_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)、哥倫比亞毒株(PCV3_COL_Risaralda1_2018)、巴西毒株(255_18_42)、智利毒株(Type 3)、美國毒株(99)、日本毒株(KGS2098-1_2016 DNA)、韓國毒株(PCV3_KU-1605)等均處于一個大分支上,屬于PCV3a亞群。

    2.4 PCV3 毒株ORF1 基因核苷酸序列比對及推導(dǎo)氨基酸序列分析

    將獲得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 ORF1 基因序列(長度891 bp)與國內(nèi)外38 個毒株進行核苷酸同源性和遺傳進化分析。結(jié)果顯示,PCV3_USA2021 與38 個參考毒株ORF1 基因核苷酸序列同源性為99.1%~99.9%。其中PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)、智利毒株(Type 3)、巴西毒株(255_18_42)、西班牙毒株(35)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國山西毒株(PCV3_Pig_CN_ShanXi170709)等7 條毒株ORF1 基因序列同源性最高,與俄羅斯毒株(PCV3-RU/SM17)及墨西哥毒株(PCV3/MEX/GTO/01/2017)同源性最低。

    PCV3_USA2021 ORF1 基因序列推導(dǎo)的Rep 蛋白氨基酸序列(長度297 aa)與國內(nèi)外38 個毒株同源性為95.3%~100%。其中,PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)、德國毒株(DE7.3)、智利毒株(Type 3)、巴西毒株(255_18_42)、越南毒株(NNH/DN7/2018)、西班牙毒株(35)、中國江西毒株(PCV3_CN_Jiangxi-62_2016)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國湖北毒株(CN/Hubei-618/2016)、中國山西毒 株(PCV3_Pig_CN_ShanXi170709)、中 國 吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)、中國福建毒株(FJ37)等14 條毒株推導(dǎo)的Rep 蛋白氨基酸序列同源性最高,與中國廣東毒株(PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016)同源性最低。

    2.5 PCV3 毒株ORF2 基因核苷酸序列比對及推導(dǎo)氨基酸序列分析

    將獲得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 ORF2基因序列(長度645 bp)與國內(nèi)外38 個毒株進行核苷酸同源性和遺傳進化分析。結(jié)果顯示,PCV3_USA2021 與國內(nèi)外38 個毒株ORF2 基因核苷酸序列同源性為98.0%~100%。其中PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)ORF2基因同源性最高,與中國安徽毒株(PCV3/CN/Anhui-14/201611)同源性最低。

    PCV3_USA2021 ORF2 基因序列推導(dǎo)的Cap蛋白氨基酸序列(長度214 aa)與國內(nèi)外38 個毒株同源性為97.7%~100%。其中,PCV3_USA2021與美國毒株(PCV3-US_SD2016、99 和2164)、塞爾維亞毒株(NIVS)、西班牙毒株(35)、巴西毒株(255_18_42)、哥倫比亞毒株(PCV3_COL_Risaralda1_2018)、匈牙利毒株(PCV3/HU/Szerencs/2017)、韓國毒株(PCV3_KU-1605)、墨西哥毒株(PCV3/MEX/GTO/01/2017)、意大利毒株(PCV3-IT_CO2017)、日本毒株(KGS2098-1_2016 DNA)、智利毒株(Type 3)、中國山西毒株(PCV3_Pig_CN_ShanXi170709)、中國廣東毒株(PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016)、中國福建毒株(FJ37)、中國南京毒株(PCV3 CN Nanjing 2017)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國江西毒株(PCV3_CN_Jiangxi-62_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)等21 條毒株推導(dǎo)的氨基酸序列同源性最高,與俄羅斯毒株(PCV3-RU/SM17)同源性最低。

    采用生物信息學(xué)軟件對所得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 與國內(nèi)外38 個毒株Cap 蛋白進行氨基酸位點突變分析。結(jié)果(表3)顯示,39 條氨基酸序列之間存在16 個突變位點,分別位于5、7、24、27、56、75、77、88、104、124、132、139、150、156、169、211 aa 位置,而本次擴增毒株P(guān)CV3_USA2021 以上位點沒有突變。

    表3 PCV3 Cap 蛋白氨基酸突變位點比對分析

    3 討論

    本研究通過采集死亡的進口美國種豬組織,設(shè)計引物擴增、拼接后,獲取1 條全基因組長度約為2 000 bp 的PCV3 全基因序列,將對應(yīng)毒株命名為PCV3_USA2021。然后將其與GenBank 收錄的38 個國內(nèi)外不同地區(qū)PCV3 參考毒株進行全基因組序列、ORF1 和ORF2 序列比對。分析結(jié)果顯示,該毒株全基因組序列與參考毒株全基因組具有較高的同源性(98.7%~99.8%),表明不同地區(qū)PCV3 的分布沒有明顯的地域性,PCV3 基因遺傳進化特性相對穩(wěn)定。同時,獲得的PCV3 毒株全基因組序列與國內(nèi)外38 條PCV3 毒株之間的ORF1 及ORF2 的同源性(分別為99.1%~99.9%和98.0%~100%)均高于全基因組序列之間的同源性,且ORF2 基因推導(dǎo)的Cap 蛋白氨基酸之間同源性為97.7%~100%,其中與21 條毒株Cap 蛋白氨基酸序列完全一致。分析結(jié)果表明,PCV3 進化相對比較保守。其中,毒株P(guān)CV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)同源性最高(99.8%),且通過構(gòu)建進化樹分析發(fā)現(xiàn),該毒株與美國毒株(PCV3-US_SD2016)親緣關(guān)系最近。

    根據(jù)全基因組序列比對獲得的進化樹分析結(jié)果,推定毒株P(guān)CV3_USA2021 為PCV3a 亞型。2016—2018 年美國中西部地區(qū)PCV3 流行情況研究報道[14]顯示,PCV3a 和PCV3b 兩種亞型在美國中西部廣泛流行。本研究獲取的毒株來自美國中西部地區(qū)(內(nèi)布拉斯加州)進口種豬,與該報道的PCV3a 亞型在美國中西部流行情況一致。

    PCV3 Cap 蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白,可誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。Cap 蛋白氨基酸位點24 位于PCV3 抗體識別表位[19]。Cap 蛋白序列氨基酸位點比對結(jié)果顯示,PCV3a 和PCV3b ORF2基因編碼蛋白的氨基酸位點分別為纈氨酸(V)和丙氨酸(A),說明不同亞種PCV3 毒株可能在抗原性方面存在差異,需進一步研究。因此在種豬引種時,除做好病原檢測外,還應(yīng)結(jié)合產(chǎn)地疫病流行情況,選擇針對流行毒株的疫苗,提高疫苗免疫保護率,減少經(jīng)濟損失。

    猜你喜歡
    核苷酸毒株基因組
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進展
    徐長風(fēng):核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    法國發(fā)現(xiàn)新冠新變異毒株IHU
    牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    廣西鴨圓環(huán)病毒流行毒株遺傳變異分析
    牛傳染性鼻氣管炎IBRV/JZ06-3基礎(chǔ)毒株毒力返強試驗
    廣東人群8q24rs1530300單核苷酸多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的相關(guān)性研究
    豬瘟強毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    狂野欧美激情性xxxx| 国产99久久九九免费精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| e午夜精品久久久久久久| 久久久国产成人精品二区 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 99re在线观看精品视频| 啦啦啦免费观看视频1| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜视频精品福利| 国产精品亚洲一级av第二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 9色porny在线观看| 高清在线国产一区| 国产精品1区2区在线观看. | 两人在一起打扑克的视频| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久这里只有精品19| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品在线美女| 涩涩av久久男人的天堂| 国产亚洲一区二区精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲av第一区精品v没综合| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 美女午夜性视频免费| 精品久久久久久,| 身体一侧抽搐| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 少妇粗大呻吟视频| 欧美黑人精品巨大| 久久久久久久精品吃奶| av网站在线播放免费| 一本综合久久免费| 男女午夜视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 在线av久久热| 激情在线观看视频在线高清 | 制服人妻中文乱码| 国产精品久久久久久精品古装| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精华国产精华精| 婷婷丁香在线五月| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 捣出白浆h1v1| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人手机av| 久9热在线精品视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 美女视频免费永久观看网站| 午夜精品国产一区二区电影| 99久久人妻综合| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美日韩黄片免| 身体一侧抽搐| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 午夜影院日韩av| 一区福利在线观看| 精品一区二区三卡| 久久久国产欧美日韩av| 婷婷成人精品国产| 美女视频免费永久观看网站| 热re99久久精品国产66热6| 国产99白浆流出| 久久人人97超碰香蕉20202| 无遮挡黄片免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲免费av在线视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 乱人伦中国视频| 国产av精品麻豆| 国产97色在线日韩免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久狼人影院| 又大又爽又粗| 一级毛片女人18水好多| 免费看a级黄色片| 久久中文字幕一级| 国产精品免费大片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产人伦9x9x在线观看| 国产在视频线精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| avwww免费| 亚洲av电影在线进入| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品国产美女av久久久久小说| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品成人在线| 欧美成人免费av一区二区三区 | 色在线成人网| 国产一区二区激情短视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 性少妇av在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美性长视频在线观看| 老熟女久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲专区国产一区二区| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜福利在线观看吧| 在线av久久热| 黄色毛片三级朝国网站| 动漫黄色视频在线观看| 国产又爽黄色视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| a在线观看视频网站| 极品人妻少妇av视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇 在线观看| 国产又爽黄色视频| 天堂中文最新版在线下载| 极品人妻少妇av视频| xxx96com| 国产精品1区2区在线观看. | av网站免费在线观看视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 大码成人一级视频| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜免费鲁丝| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 丝袜美足系列| 久久久精品区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 久久国产精品大桥未久av| 一进一出抽搐动态| 超碰成人久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 最新在线观看一区二区三区| 黄色成人免费大全| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产野战对白在线观看| 国产精品成人在线| 色老头精品视频在线观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲免费av在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 动漫黄色视频在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品久久电影中文字幕 | 免费黄频网站在线观看国产| 国产免费现黄频在线看| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美大码av| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲久久久国产精品| 两性夫妻黄色片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 免费日韩欧美在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美日韩乱码在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美最黄视频在线播放免费 | 无限看片的www在线观看| 午夜免费成人在线视频| 亚洲av电影在线进入| 人人妻人人澡人人看| 日日爽夜夜爽网站| 黄色 视频免费看| 亚洲精品美女久久av网站| 久久久国产成人免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黑丝袜美女国产一区| 高清av免费在线| 一区二区三区激情视频| 人成视频在线观看免费观看| 丁香六月欧美| 午夜免费观看网址| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 91字幕亚洲| 国产成人精品久久二区二区91| 久久青草综合色| videos熟女内射| 性色av乱码一区二区三区2| 电影成人av| 在线视频色国产色| av有码第一页| 99精品久久久久人妻精品| 人人澡人人妻人| 中文亚洲av片在线观看爽 | 69精品国产乱码久久久| 国产精品免费视频内射| 亚洲精品中文字幕一二三四区| xxx96com| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 欧美日韩一级在线毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| a级毛片在线看网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲第一av免费看| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲avbb在线观看| 免费看a级黄色片| 久久九九热精品免费| 老司机亚洲免费影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲第一青青草原| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 麻豆国产av国片精品| 岛国在线观看网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| a在线观看视频网站| 不卡av一区二区三区| 久久久久精品人妻al黑| 91大片在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲人成电影观看| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲 国产 在线| 天天添夜夜摸| 悠悠久久av| 亚洲片人在线观看| 国产成人精品无人区| 国产激情久久老熟女| 久久国产精品影院| 一进一出好大好爽视频| 又大又爽又粗| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 丁香六月欧美| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩乱码在线| 黑人猛操日本美女一级片| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲中文av在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 丝袜在线中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美久久黑人一区二区| 久久中文看片网| 国产激情久久老熟女| 亚洲美女黄片视频| 国产区一区二久久| 国产精品影院久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 九色亚洲精品在线播放| 天天操日日干夜夜撸| 黑人操中国人逼视频| 亚洲久久久国产精品| 国产片内射在线| 午夜福利欧美成人| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜视频精品福利| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 最新的欧美精品一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 热99国产精品久久久久久7| 黑丝袜美女国产一区| 日日爽夜夜爽网站| 五月开心婷婷网| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人国产一区最新在线观看| 久久九九热精品免费| 久久国产精品影院| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 这个男人来自地球电影免费观看| 97人妻天天添夜夜摸| 久久精品国产亚洲av高清一级| 9191精品国产免费久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品永久免费网站| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 午夜福利欧美成人| 午夜久久久在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 精品久久久久久电影网| 国产精品影院久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 91大片在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产成人系列免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| av线在线观看网站| av片东京热男人的天堂| 极品少妇高潮喷水抽搐| 在线av久久热| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成人黄色视频免费在线看| 一二三四在线观看免费中文在| 大型av网站在线播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久中文字幕人妻熟女| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 午夜福利在线免费观看网站| 丁香六月欧美| 露出奶头的视频| 中文字幕高清在线视频| 90打野战视频偷拍视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲性夜色夜夜综合| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 成年人免费黄色播放视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲熟妇熟女久久| 9色porny在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲熟妇熟女久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 真人做人爱边吃奶动态| 国产免费现黄频在线看| 午夜福利影视在线免费观看| 18禁美女被吸乳视频| 高清欧美精品videossex| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久精品国产综合久久久| 免费高清在线观看日韩| 亚洲专区字幕在线| 69av精品久久久久久| 下体分泌物呈黄色| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 免费人成视频x8x8入口观看| 九色亚洲精品在线播放| 黄片大片在线免费观看| 成人av一区二区三区在线看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品在线观看二区| 国产97色在线日韩免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 伦理电影免费视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品第一国产精品| 91精品三级在线观看| 一级毛片女人18水好多| 国产免费现黄频在线看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人影院久久| 亚洲久久久国产精品| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久人妻av系列| 高清视频免费观看一区二区| 久久 成人 亚洲| 90打野战视频偷拍视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 最新的欧美精品一区二区| 久久久精品区二区三区| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲美女黄片视频| 午夜久久久在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲熟妇熟女久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 午夜福利免费观看在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av日韩在线播放| 午夜激情av网站| 18禁美女被吸乳视频| a级毛片黄视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 热99国产精品久久久久久7| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 女同久久另类99精品国产91| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 很黄的视频免费| 久久久国产欧美日韩av| 多毛熟女@视频| 国产精品国产av在线观看| 成人影院久久| 天堂√8在线中文| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 91在线观看av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产99白浆流出| 国产国语露脸激情在线看| 男女午夜视频在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 女性被躁到高潮视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | svipshipincom国产片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 丝袜人妻中文字幕| 欧美性长视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久中文看片网| 国产精品 欧美亚洲| 日本欧美视频一区| 亚洲欧美激情综合另类| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 中文字幕人妻熟女乱码| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人永久免费在线观看视频| 人成视频在线观看免费观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久国产成人免费| 十八禁高潮呻吟视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久青草综合色| 黑丝袜美女国产一区| 色老头精品视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| ponron亚洲| 亚洲免费av在线视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品久久久久久久毛片微露脸| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 丝袜在线中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 国产高清激情床上av| 久久热在线av| 一个人免费在线观看的高清视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久九九热精品免费| 乱人伦中国视频| 校园春色视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 国产一区二区三区视频了| 日本vs欧美在线观看视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 我的亚洲天堂| 亚洲性夜色夜夜综合| 97人妻天天添夜夜摸| 久9热在线精品视频| 91成人精品电影| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久国产一区二区| 国产不卡一卡二| 少妇的丰满在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 精品久久久久久电影网| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 女警被强在线播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 岛国毛片在线播放| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩大码丰满熟妇| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 捣出白浆h1v1| www日本在线高清视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品影院久久| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产三级黄色录像| 热99国产精品久久久久久7| 青草久久国产| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 成人18禁在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人av教育| 日韩欧美一区视频在线观看| 美女福利国产在线| 久久久久久久精品吃奶| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 大香蕉久久成人网| 精品亚洲成a人片在线观看| 正在播放国产对白刺激| 黄色视频,在线免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久这里只有精品19| 在线永久观看黄色视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 高清在线国产一区| 黑丝袜美女国产一区| 麻豆乱淫一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久国产成人免费| 精品视频人人做人人爽| 一级毛片高清免费大全| 最近最新免费中文字幕在线| 精品人妻1区二区| 久久人妻av系列| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一区二区三区激情视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日本黄色日本黄色录像| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲人成伊人成综合网2020| 丰满的人妻完整版| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲 欧美一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 色94色欧美一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| e午夜精品久久久久久久| 高清视频免费观看一区二区| www日本在线高清视频| 女警被强在线播放| 1024香蕉在线观看| av电影中文网址| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜日韩欧美国产| 又大又爽又粗| 亚洲国产精品sss在线观看 | 国产精品国产高清国产av | 两个人免费观看高清视频| netflix在线观看网站| 国产成人影院久久av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄片播放在线免费| 亚洲七黄色美女视频| 91字幕亚洲| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩免费av在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 日本a在线网址| 午夜视频精品福利| 欧美中文综合在线视频| 捣出白浆h1v1| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 嫁个100分男人电影在线观看| 国产成人系列免费观看| 久久 成人 亚洲| a在线观看视频网站| 国产又爽黄色视频| 亚洲成人手机| 香蕉国产在线看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 天堂√8在线中文| 亚洲专区国产一区二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久久久精品人妻al黑| 少妇 在线观看| 性少妇av在线| 捣出白浆h1v1| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品久久蜜臀av无| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品国产亚洲在线| 久久久国产一区二区| 99国产综合亚洲精品| 久久久久久人人人人人|