輪作休耕模式對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

南麗麗，郭全恩，譚杰輝，康發(fā)云

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅省永靖縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 永靖 731600)

黃土高原是中國文明發(fā)祥地及主要旱作農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)[1]。近年來，由于降雨集中、植被覆蓋度降低、特殊的土壤性質(zhì)以及人類不合理的利用導(dǎo)致黃土高原水土流失日益嚴(yán)重，現(xiàn)已成為國內(nèi)水土流失最嚴(yán)重的區(qū)域[2]。水土資源的短缺與流失嚴(yán)重制約了黃土高原區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，限制黃土區(qū)生態(tài)恢復(fù)和土地生產(chǎn)力提高[3]。為了堅(jiān)守耕地紅線，保障國家糧食安全，更好地實(shí)施“藏糧于地、藏糧于技”戰(zhàn)略，實(shí)現(xiàn)節(jié)約地下水、保護(hù)生態(tài)環(huán)境的目標(biāo)，國家提出在部分地區(qū)探索試行耕地輪作休耕制度。2016年，將河北省地下水漏斗區(qū)、湖南省長株潭重金屬污染區(qū)、貴州及云南省石漠化區(qū)、甘肅省生態(tài)嚴(yán)重退化區(qū)作為我國的休耕試點(diǎn)區(qū)[4]。這對(duì)提高我國土壤質(zhì)量、促進(jìn)農(nóng)業(yè)提質(zhì)增效[5]、維護(hù)食品安全和保障生態(tài)安全[6]均具有重要意義。

已有研究表明，稻麥還田[7]、麥秸還田[8]、綠肥還田[9-10]、耕作方式[11]等能夠顯著改變土壤細(xì)菌群落；農(nóng)田種植制度[12]、耕作方式(如免耕、旋耕、深松)[13]、休耕[14]等對(duì)物種多樣性有重要影響。而有關(guān)甘肅省生態(tài)嚴(yán)重退化區(qū)輪作休耕模式與技術(shù)措施對(duì)細(xì)菌群落的影響少見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)對(duì)甘肅省黃土高原半干旱區(qū)不同輪作休耕模式下土壤化學(xué)性質(zhì)及細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了研究，從微生物和養(yǎng)分的角度探討黃土高原半干旱地區(qū)休耕輪作最佳模式，旨在為該地區(qū)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，亦為我國科學(xué)推行休耕輪作制度試點(diǎn)工作提供現(xiàn)實(shí)參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于甘肅省永靖縣新寺鄉(xiāng)大灣峴村(36°00′N，103°12′E)，地處隴西黃土高原丘陵溝壑區(qū)，境內(nèi)山大溝深，土質(zhì)疏松，水土流失嚴(yán)重，屬溫帶半干旱偏旱氣候類型，海拔1 957 m，年均溫度8.7℃，>10℃積溫2 750℃，年均降雨量260 mm，且年際、季節(jié)性分布不均，降雨主要集中在7—9月，蒸發(fā)量高達(dá)1 500 mm。樣地0～20 cm土層的pH值為8.24，全氮、全磷、全鉀、有機(jī)質(zhì)含量分別為1.09、0.15、8.25、3.45 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，于2017年5月設(shè)置9種輪作休耕模式(表1)，小區(qū)面積56 m2(7 m×8 m)，區(qū)間距為80 cm，3次重復(fù)。豆科綠肥作物豌豆(Pisumsativum)、毛苕子(Iiciavillosa)和箭筈豌豆(Viciasativa)的播種量分別為90、45、70 kg·hm-2，播種深度3 cm，行距30 cm。休耕第3年即2019年9月21日用土鉆在各小區(qū)按“S”形路線采取0～20 cm土層土樣，3次重復(fù)。土樣混勻后裝入滅菌袋中用冰盒帶回，在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。土樣分為兩份，一份用于土壤化學(xué)指標(biāo)測(cè)定，另一份用于土壤微生物總DNA提取。

表1 不同輪作休耕模式

1.3 測(cè)定方法

土壤化學(xué)指標(biāo)測(cè)定：土壤全氮(total nitrogen，TN)采用凱氏定氮法測(cè)定，全磷(total phosphorus，TP)采用HC1O4-濃H2SO4外加熱消煮法(分光光度法)測(cè)定，全鉀(total potassium，TK)采用HClO4-HF外加熱消煮法(火焰光度法)測(cè)定，速效氮(available nitrogen，AN)采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效磷(available phosphorus，AP)采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀(available potassium，AK)采用NH4OAc浸提(火焰光度法)測(cè)定，有機(jī)質(zhì)(organic matter，OM)采用重鉻酸鉀容量法(外加熱法)測(cè)定，土∶水為1∶5懸液用pH S-4智能酸度計(jì)測(cè)定[15]。

土壤總DNA提取及細(xì)菌16 SrRNA基因擴(kuò)增：采用CTAB法對(duì)土壤基因組DNA進(jìn)行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μl-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)采用帶Barcode的特異性引物[16](515F和806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品3次重復(fù)。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。對(duì)Illumina NovaSeq測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw PE)進(jìn)行拼接和質(zhì)控[17]，得到Clean tags，再進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(effective tags)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Uparse軟件對(duì)樣品的有效序列進(jìn)行OTUs聚類(Operational Taxonomic Units，相似度97%以上)，用Mothur方法[18]與Silva軟件的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[19]進(jìn)行物種注釋(設(shè)定閾值為0.8～1.0)；采用MUSCLE(3.8.31)軟件[20]進(jìn)行快速多序列比對(duì)，最后對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Qiime(1.9.1)軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，使用R軟件(2.15.3)繪制稀釋曲線。

用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用 Duncan 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。用CANOCO 4.0軟件對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落與土壤化學(xué)指標(biāo)間的相互關(guān)系進(jìn)行冗余分析，并采用Monte Carlo置換檢驗(yàn)計(jì)算因子的重要性，其中置換次數(shù)設(shè)為999次，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

由表2可知，不同輪作休耕模式對(duì)土壤全量養(yǎng)分、速效養(yǎng)分、有機(jī)質(zhì)及pH值均有顯著影響(P<0.05)。其中全氮、全磷、全鉀含量的變化范圍分別為3.97～11.97 g·kg-1，0.16～0.26 g·kg-1，9.49～11.08 g·kg-1，全氮含量各處理均顯著高于CK；全磷含量T5和T6處理顯著大于CK，其余處理與CK差異不顯著；全鉀含量T2處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著高于CK。各處理速效氮、速效磷、速效鉀含量分別在98.14～124.44 mg·kg-1、0.81～2.62 mg·kg-1、28.85～43.15 mg·kg-1范圍內(nèi)變化，其中速效氮含量T2處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著低于CK；速效磷含量T5和T6處理顯著低于CK，T7處理與CK差異不明顯，其余處理均顯著高于CK；速效鉀含量T5和T6處理顯著低于CK，T1處理顯著大于CK，其余處理與CK差異均不顯著。T1、T2、T6處理的有機(jī)質(zhì)含量與CK差異不顯著，其他處理均顯著小于CK。pH值T1、T6、T7處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著低于CK。

表2 各樣地土壤化學(xué)性質(zhì)

2.2 土壤細(xì)菌群落豐度與Alpha多樣性分析

由表3可知，通過高通量測(cè)序，過濾掉低質(zhì)量的序列后，CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8處理的有效序列分別為78325、80788、79104、77342、81711、82409、83994、78413、81662；OTU數(shù)分別為3271、3536、3321、3342、3352、3490、3199、3298、3461。由圖1可知，各樣品文庫的覆蓋度均在98%以上，并結(jié)合樣品稀釋曲線均趨于平緩，說明本研究測(cè)序數(shù)據(jù)合理，能夠準(zhǔn)確反映出土壤細(xì)菌群落的真實(shí)信息。不同處理土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)和ACE 指數(shù))T7處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著高于CK，且T3處理最大；細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Simpson和Shannon-wiener指數(shù))各處理間差異不顯著。由圖2可知，所有樣品中共有OTUs數(shù)目為2474個(gè)，其中CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8各處理中所特有的OTUs 數(shù)目分別為108、209、116、91、102、111、76、123和115個(gè)。

表3 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)、豐富度與多樣性指數(shù)Table 3 Sample sequence numbers statistics, richness and diversity index

圖1 樣品稀釋曲線

圖2 土壤細(xì)菌OTUs分布花瓣圖

2.3 不同輪作休耕模式土壤細(xì)菌群落分布

2.3.1 門水平上的群落組成 由圖 3可知，各處理細(xì)菌群落相對(duì)豐度從大到小位于前十位的細(xì)菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria)(26.33%～37.33%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(17.93%～21.43%)、放線菌門(Actinobacteria)(12.42%～19.41%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(6.98%～10.99%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(6.48%～10.50%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(3.10%～8.95%)、棒狀桿菌門(Rokubacteria)(1.97%～3.53%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(1.63%～2.37%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(0.72%～1.17%)、奇古菌門(Thaumarchaeota)(0.18%～1.14%)，共占細(xì)菌總數(shù)的93.37%～95.85%。其中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門占細(xì)菌總數(shù)的81.50%～87.01%，說明這5個(gè)門的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群。除疣微菌門外，不同處理細(xì)菌在門分類水平上相對(duì)豐度有一定的差異，其中變形菌門、擬桿菌門T2處理顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK無明顯差異；酸桿菌門T8處理顯著小于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；放線菌門T1、T2處理顯著低于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；芽單胞菌門T6、T7處理顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；綠彎菌門T2處理顯著低于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；棒狀桿菌門T2、T6、T8處理顯著小于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不明顯；奇古菌門T8處理最高并顯著大于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；硝化螺旋菌門T1、T5處理顯著大于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著。

圖3 門分類水平下的細(xì)菌群落相對(duì)豐度

2.3.2 屬水平上的群落組成 由圖4可知，各處理細(xì)菌群落相對(duì)豐度從大到小位于前十位的細(xì)菌屬分別為：鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Adhaeribacter屬、未分類酸桿菌屬、內(nèi)共生菌屬(Buchnera)、芽生球菌屬(Blastococcus)、黃桿菌屬(Flavisolibacter)、黃曲霉屬(Flaviaesturariibacter)、Gaiella屬、Haliangium屬、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)，其他類群的相對(duì)豐度占80.07%～87.70%。除未分類酸桿菌屬外，細(xì)菌在屬分類水平上各處理相對(duì)豐度有一定的差異。其中鞘氨醇單胞菌屬、Adhaeribacter屬、黃曲霉屬和黃桿菌屬T2處理均顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；芽生球菌屬T1處理顯著低于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；Gaiella屬T1、T2、T3處理顯著小于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不明顯；Haliangium屬T1、T4處理差異不顯著，且均顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；芽單胞菌屬T3、T6、T7、T8處理顯著大于CK(P<0.05)，其余處理與CK差異不顯著；內(nèi)共生菌屬各處理間無明顯差異。

圖4 屬分類水平下的細(xì)菌群落相對(duì)豐度

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)的關(guān)系

為進(jìn)一步分析不同土壤環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析(圖5)。結(jié)果表明，RDA1、RDA2分別解釋總變異的47.95%和8.49%。其中變形菌門、疣微菌門與速效氮、速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，與全磷、全氮呈負(fù)相關(guān)；放線菌門、綠彎菌門、奇古菌門與全氮、全磷、全鉀呈正相關(guān)，與速效氮、速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)；芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、酸桿菌門、棒狀桿菌門與全鉀、pH呈正相關(guān)，而擬桿菌門與全鉀、pH呈負(fù)相關(guān)。置換檢驗(yàn)的結(jié)果顯示(表4)，全氮、全鉀、速效氮是主導(dǎo)細(xì)菌群落變化的主要因子。

表4 冗余分析Monte Carlo置換檢驗(yàn)結(jié)果

圖5 細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子冗余分析

3 討 論

土壤細(xì)菌不僅能夠快速、高效地分解與轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)[21]、影響植物對(duì)養(yǎng)分的獲取和土壤肥力，而且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異和變化規(guī)律能反映土壤現(xiàn)狀及變化趨勢(shì)，可用來指示土壤生態(tài)功能[22]。通過對(duì)不同輪作休耕處理10大優(yōu)勢(shì)菌門分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門是本研究中的優(yōu)勢(shì)菌門，這一結(jié)果與多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相一致[23-24]。變形菌門是土壤中最主要的細(xì)菌類群,其代謝活動(dòng)是土壤中最主要的細(xì)菌活動(dòng)[25]。

酸桿菌門是嗜酸菌，植被類型會(huì)影響其分布[26]，不同休耕輪作模式使土壤pH值下降(pH值由8.24下降為7.26～7.39)，有利于酸桿菌生存。放線菌門是土壤養(yǎng)分供給的主要來源，其產(chǎn)生的孢子能夠抵抗外界不利的環(huán)境條件[27]。芽單胞菌門是典型的植物促生菌，通過與植物互作，進(jìn)行生物固氮，誘導(dǎo)植物分泌植物激素，促進(jìn)植物生長。綠彎菌具有生態(tài)恢復(fù)的能力，可以增強(qiáng)土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[28]，本研究顯示T2處理(伏天深耕)的綠彎菌較低，其余輪作休耕模式均優(yōu)化了土壤環(huán)境。

土壤微生物參與完成土壤中各種復(fù)雜的生化反應(yīng)過程[29]。本研究表明，土壤細(xì)菌群落多樣性(Shannon和Simpson)指數(shù)無顯著性變化，這是由于樣地具有相同的田間管理模式，表明樣地土壤細(xì)菌群落均勻度較高；細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao1和ACE)，除T7處理外，其余輪作休耕模式均高于CK，這是由于不同休耕輪作模式根系分泌物的不同影響了土壤細(xì)菌群落多樣性[30]。

大量研究表明，土壤化學(xué)性質(zhì)與土壤微生物關(guān)系密切[22,31-32]。本研究中土壤優(yōu)勢(shì)菌門與土壤化學(xué)因子都有一定的相關(guān)性，其中土壤全氮、全鉀、速效氮含量是主導(dǎo)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化的主要因子，表明不同休耕輪作模式的土壤化學(xué)性質(zhì)不同，改變了微生物物種組成及其結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

在門分類水平上，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門是黃土高原半干旱區(qū)不同輪作休耕模式下土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，占整個(gè)細(xì)菌類群豐富度的81.50%～87.01%，其中T6處理的豐富度最大為87.01%，T2處理的豐富度最低為81.50%；T1、T5處理顯著升高了硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度，T2處理顯著提高了變形菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度，T6、T7處理顯著增加了芽單胞菌門的相對(duì)豐度，T8處理顯著增高了奇古菌門的相對(duì)豐度。不同輪作休耕模式的土壤全氮含量均顯著高于CK，土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao1和ACE)除T7處理外，其余處理均顯著高于CK；土壤全氮、全鉀、速效氮含量是不同輪作休耕模式土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演變的重要因素。