混合陳舊斷骨的尸源鑒定1例

（北京華大方瑞司法物證鑒定中心，北京 101318）

1 案 例

1.1 簡要案情

2017年7月，本鑒定中心受某地委托，要求幫助趙某（男）和朱某（男）從40余塊混合的陳舊斷骨檢材中找到親屬的遺骨。通過溝通了解到，在某湖的施工過程中，誤挖出40余塊陳舊骨骼，其中有趙某父親（死于1967年）和朱某爺爺（死于1949年）的尸骨。

1.2 DNA檢驗

1.2.1 DNA提取

樣本為45塊骨骼樣本（依次編為1～45號）、趙某血痕樣本（編為46號）以及朱某血痕樣本（編為47號）。用手術(shù)刀和超純水清理骨骼樣本表面，清洗干凈后自然晾干。45塊骨骼樣本大部分為斷骨，骨髓腔內(nèi)充滿泥土，長短不一（7～28 cm），大部分表現(xiàn)為中空、手感輕、硬度低、韌性差，部分骨骼可輕易折斷。

用電鉆鉆取骨骼樣本較厚的部位獲得骨屑。骨骼DNA的提取純化采用MagAttract M48 DNA Manual試劑盒（德國Qiagen公司，簡稱M48試劑盒）。各樣本取2g骨屑分別置于50mL離心管中，加入1000μL消化液 Buffer G2（德國 Qiagen公司）、300 μL脫鈣液［0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），pH=8.0］、200 μL二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）溶液（1 mol/L）以及200 μL蛋白酶K溶液（20 mg/mL），液面淹沒檢材，振蕩混勻，將樣本置于56℃恒溫水浴搖床中消化，其間補加1次蛋白酶K溶液和DTT溶液。后續(xù)DNA提取純化參照M48試劑盒說明書進行，用預(yù)熱的洗脫液重復(fù)洗脫1次，洗脫體系為30μL。

趙某和朱某的血痕樣本采用《法庭科學(xué)DNA實驗室檢驗規(guī)范》（GA/T 383—2014）中的Chelex法提取DNA。

1.2.2 PCR擴增與STR分型

取上述DNA溶液為模板，依次采用GlobalFilerTMExpress PCR Amplification Kit（美國 Applied Biosystems公司）和Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)26Y［基點認知技術(shù)（北京）有限公司］在9700型PCR儀（美國Applied Biosystems公司）上進行復(fù)合擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3500xL基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）進行毛細管電泳，采用GeneMapperTMID-X v1.5軟件進行基因型分析。

反應(yīng)體系和操作程序均按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

1.2.3 檢驗結(jié)果

2、11、15號骨骼樣本中檢出部分STR分型，46、47號血痕樣本得到完整分型，2、11、15、46、47號樣本在常染色體STR基因座的分型結(jié)果見表1。

11號骨骼樣本和46號血痕樣本在檢出的20個常染色體STR基因座的分型結(jié)果均符合孟德爾遺傳定律，經(jīng)計算，累積親權(quán)指數(shù)大于10000；11號骨骼樣本和46號血痕樣本檢出的Y-STR分型結(jié)果一致，參照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T 37223—2018），支持11號骨骼樣本所屬個體與趙某（46號樣本所屬個體）為生物學(xué)父子關(guān)系。

參照文獻[1-2]的方法，用ITO法計算2號骨骼樣本與47號血痕樣本的祖孫關(guān)系指數(shù)?；贗TO法，祖孫關(guān)系具有同源基因的概率（φ值）與半同胞關(guān)系一樣，故用ITO法計算兩個人的祖孫關(guān)系指數(shù)可參照半同胞指數(shù)（half sibling index，HSI）的計算。經(jīng)計算，2號骨骼樣本與47號血痕樣本的祖孫關(guān)系指數(shù)大于19，傾向于認為2號骨骼樣本所屬個體與朱某（47號樣本所屬個體）為祖孫親緣關(guān)系。同時，2號骨骼樣本與47號血痕樣本的Y-STR分型結(jié)果一致，不排除具有同一父系親緣關(guān)系，可輔助判斷上述結(jié)果。

表1 2、11、15、46、47號樣本常染色體STR基因座的分型結(jié)果Tab.1 Typing result of autosomal STR gene locus of No.2，11，15，46，47 samples

2 討 論

陳舊性骨骼樣本受保存時間和環(huán)境因素的影響，骨骼中的糖蛋白等蛋白質(zhì)可能和DNA產(chǎn)生亞甲基化學(xué)交聯(lián)。DNA的氧化導(dǎo)致堿基的缺失或更迭，酸、堿催化作用都可導(dǎo)致堿基本身水解脫氨基，保存時間和環(huán)境等因素的影響可導(dǎo)致骨骼DNA嚴重降解[3]，因此如何提取高質(zhì)量的DNA是骨DNA分析的關(guān)鍵。

隨著DNA提取技術(shù)的發(fā)展以及提取經(jīng)驗的積累，骨骼DNA的提取方法多樣并不斷優(yōu)化，骨骼DNA的提取不再是難題，尤其是保存時間在30年以內(nèi)、保存狀態(tài)完整的骨骼樣本，DNA檢出率高達90%以上[4]。本案例中，45塊骨骼樣本中僅檢出3個樣本的STR分型，推測原因為：（1）骨骼保存年限較長，為50年以上；（2）骨骼完整程度不佳，大部分為斷骨，多表現(xiàn)為中空、手感較輕、韌性差等，這都為本案例骨骼的DNA提取工作增加了難度。檢索文獻[5-7]并結(jié)合現(xiàn)有的實驗條件和檢驗經(jīng)驗，現(xiàn)對此類樣本的提取方法總結(jié)如下：（1）增加骨屑用量，適當(dāng)延長消化時間。因檢材較陳舊，骨骼細胞中DNA降解嚴重，DNA提取純化過程中會損失部分DNA，所以增加骨屑用量，延長裂解消化時間，可促使骨骼細胞中的微量DNA充分釋放。（2）裂解消化與脫鈣同時進行。人類骨組織細胞間質(zhì)主要由膠原蛋白和羥基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］構(gòu)成，EDTA作為一種螯合劑可螯合間質(zhì)中起穩(wěn)固作用的鈣，從而破壞骨組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使骨骼中的DNA更充分地釋放[6]。但是骨骼樣本在脫鈣過程中會導(dǎo)致部分DNA的流失，所以裂解和消化同時進行既可減少DNA的損失，又可節(jié)省時間，還可以減少操作步驟避免DNA的污染。（3）減少洗脫體積。本案例中使用M48試劑盒提取，洗脫體積為30μL，且用預(yù)熱的洗脫液重復(fù)洗脫1次，可增加DNA獲得率，有效提高DNA模板的濃度。

在峰圖判型方面，單純一次的實驗結(jié)果并不可靠，李成濤等[8]也提出實驗室工作人員對微量或高度降解的檢材進行檢測時須特別注意防止污染，對于某些重復(fù)性不好或雜峰較多的基因座，將不予采信?？傊?，微量檢材的判型必須嚴謹、慎重。