文/張蕭蕭,劉麗艷,黃寧,陳軍利(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室)
α2 腎上腺素受體(α2-adrenergic receptor, α2-AR)是GPCR 超家族的一種膜蛋白,是內(nèi)源性兒茶酚胺的受體,該受體有三種亞型,分別是α2A、α2B 和α2C[1-2]。α2-AR 可調(diào)節(jié)多種生理病理過程的發(fā)生發(fā)展,例如痛覺[3]、抑郁癥[4-5]、青光眼[6]、肝纖維化[7]等。因此,α2-AR 可能是治療上述疾病的重要靶點之一。多種以α2-AR 為靶點的藥物已經(jīng)上市并運用與臨床,如右旋美托咪定[5]、替托尼定[8]等。然而,目前以α2-AR為靶點的藥物存在許多問題,如對各亞型的選擇性差、副作用大等。因此,繼續(xù)研究新型以α2-AR 為靶點的藥物迫在眉睫。
近年來多項研究表明,別構(gòu)調(diào)節(jié)劑具有副作用小、選擇性高、耐藥率低且不影響受體生理功能等作用[9-10]。目前已有文獻報道過阿米洛利類化合物對α2-AR 具有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用[11],但對α2B 和2C 的親和力及選擇性尚未見報道。本文檢測阿米洛利及Benzamil 對2B 和2C 的親和力,以探討這兩種化合物是否對α2-AR 受體亞型具有選擇性,為研發(fā)新型α2-AR 亞型選擇性藥物打下結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
COS-7 細胞(ATCC),PEI 40000(polysciences),PBS(HyClone),DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone),青霉素- 鏈霉素溶液(BioSharp),F(xiàn)BS(GIBCO),BCA 試劑盒(碧云天),3H-RX821002(PerkinElmer),酚妥拉明(Sigma),阿米洛利(MCE),Benzamil(MCE),15cm細胞培養(yǎng)皿(NEST)。
將1×107個COS-7 細胞接種于20ml含有FBS 和雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基的15cm 培養(yǎng)皿中,在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染前1 小時,將培養(yǎng)液換為不含F(xiàn)BS 和雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基。將質(zhì)離DNA 與PEI40000 按1:3 混合,室溫靜置15 分鐘加入細胞培養(yǎng)皿中,在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4-6 小時,將培養(yǎng)液換為含F(xiàn)BS 和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,48-72 小時后,提取膜蛋白。用10ml 4℃ PBS清洗細胞兩次,收集細胞于50ml 離心管中,離心(4℃,800g)5分鐘。用20ml HEPES 緩沖液重懸細胞,勻漿機24000r/min勻漿10秒,重復(fù)3次,每次間隔30秒。將重懸物離心(4℃,1300g)10分鐘,取上清離心(4℃,100000g)1小時,棄上清。用含10%甘油的HEM 緩沖液重懸沉淀,用1ml胰島素注射器反復(fù)吹打均勻,每管50μl 分裝,-80℃保存。BCA法檢測蛋白濃度。
將不同濃度含有目的蛋白(α2B 或α2C)的膜蛋白與2nM 的3H-RX821002室溫共孵育1 小時,非特異性結(jié)合為在100μM 酚妥拉明存在下的結(jié)合。加入4℃PBS 終止反應(yīng),通過GF/B 濾膜過濾,最后用液體閃爍儀測定放射性。
將濃度依次增加(10-3M-10-10M)的阿米洛利或Benzamil 加入到含有α2B 或α2C-AR 的膜蛋白以及3.5nM 3H-RX821002 的HEM 緩沖液中,終體積為200μl,非特異性結(jié)合為100μM酚妥拉明存在下的結(jié)合。室溫孵育1 小時,加入4 ℃ PBS 終止反應(yīng),GF / B濾膜過濾,通過液體閃爍儀對樣品放射性進行測定。
圖1 α2B-AR(A)和α2C-AR(B)表達實驗A、B:Amiloride和Benzamil對α2B-AR的親和力;C、D:Amiloride和Benzamil對α2C-AR的親和力
圖2 阿米洛利類化合物對α2-AR的親和力檢測
通過表達實驗對每次所提取的膜蛋白的目的蛋白(α2B 或α2C-AR)進行活性及表達水平檢測。如圖1A、1B 所示,配體受體總結(jié)合量隨著加入的膜蛋白量的增加而增加,非特異性結(jié)合變化不明顯,表明目的蛋白(α2B 或α2C-AR)表達量較高。對于α2B-AR(圖1A),我們選用4-8μg進行后續(xù)的配體受體競爭性結(jié)合實驗;對于α2C-AR(圖1B),我們選取6-8μg 進行后續(xù)的競爭性結(jié)合實驗。
我們通過配體受體競爭性結(jié)合實驗檢測了阿米洛利和Benzamil 對α2B-AR 和α2C-AR 的親和力。如圖2 所示,阿米洛利對α2B-AR 和α2C-AR 的IC50 分別為30.73μM 和45.59μM;Benzamil 對α2B-AR 的IC50 為1.925μM, 對α2CAR 的IC50 為0.322μM,說明Benzamil 對α2C-AR 的親和力是α2B-AR 的6 倍,對α2C-AR 具有選擇性。
α2-AR 是GPCR 超家族中的一種膜蛋白受體,有α2A、α2B 和α2C 三種受體類型參與了多種生理病理過程,例如痛覺、抑郁癥等。之前的文獻報道過阿米洛利類化合物對α2-AR 有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用,但是它們對α2B-AR 以及α2C-AC 的親和力以及選擇性尚未見報道,因此本文進行了阿米洛利類化合物對其親和力的檢測。
我們發(fā)現(xiàn)Benzamil 對這兩個亞型的親和力均大于阿米洛利,且Benzamil 對不同受體類型的親和力也不同,即對α2CAR 的親和力是α2B-AR 的6 倍,可知,Benzamil 對α2C-AR 具有受體選擇性。該結(jié)果為研發(fā)新型α2C-AR 選擇性藥物打下一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。