人體靜脈血樣采集容器中檸檬酸鈉含量的2 種測定方法的比較研究

秦 洋 沈 永 劉 葉 薄曉文 孟 凱

（1.山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心 山東濟(jì)南 250101；2.國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

1 引言

檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）是臨床血液檢驗(yàn)常用的抗凝劑之一，作用于血樣中，鈣離子與之螯合起抗凝作用。 美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦使用低濃度的抗凝劑 （0.105～0.109 mol/L），Na3C6H5O7·2H2O 抗凝劑與血液的比例是1∶9，可應(yīng)用于凝血試驗(yàn)（抗凝藥物的檢測、凝血因子分析）；血沉試驗(yàn)要求的Na3C6H5O7·2H2O 濃度是3.8%（相當(dāng)于0.129 mol/L）或3.2%（相當(dāng)于0.109 mol/L），抗凝劑與血液的比例為1∶4?？鼓齽┑臐舛戎苯佑绊懷簷z查的準(zhǔn)確性[1，2]。

《一次性使用真空采血管產(chǎn)品注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY 0314—2007《一次性使用人體靜脈血樣采集容器》[3]中對Na3C6H5O7·2H2O 抗凝劑用量予以限定，但未提供試驗(yàn)方法。有文獻(xiàn)通過非水滴定滴定數(shù)十個(gè)采血容器中Na3C6H5O7·2H2O的混合液的方法測定Na3C6H5O7·2H2O 的濃度，無法直接對單個(gè)采集容器中的Na3C6H5O7·2H2O 準(zhǔn)確定量[4]。

本文借鑒GB 1886.25—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑 檸檬酸鈉》[5]中非水滴定Na3C6H5O7·2H2O含量的方法，通過采用稀釋高氯酸滴定液、色譜純冰乙酸替代分析純控制水分影響等方面改良非水滴定，研究其可行性；Na3C6H5O7·2H2O 抗凝劑采血容器中成分單一，僅含Na3C6H5O7·2H2O 溶液，考察滲透壓法進(jìn)行Na3C6H5O7·2H2O 定量測定[6]的適用性。 同時(shí)，對2 種方法進(jìn)行比較研究，以期滿足檢測和科研工作的需要。

2 試驗(yàn)方法

2.1 滲透壓法

2.1.1 儀器與試劑

羅澤冰點(diǎn)滲透壓儀（德國羅澤公司）；電子天平（精度0.1 mg，瑞士梅特勒公司）；Na3C6H5O7·2H2O（中國食品藥品檢定研究院，高效液相色譜法含量測定用，純度為100.0%）。

2.1.2 試驗(yàn)方法

精密稱取Na3C6H5O7·2H2O 適量，配制濃度為10%的Na3C6H5O7·2H2O 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。 再精密量取上述溶液適量，制成含Na3C6H5O7·2H2O 約為2%～6%的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015 年版四部0632 滲透壓摩爾濃度測定法，測定每個(gè)濃度溶液的滲透壓值，以濃度Y（mg/mL）為縱坐標(biāo)，滲透壓值X（mOsm/kg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。同法測量采血容器中Na3C6H5O7·2H2O 溶液的滲透壓，將測定結(jié)果代入線性回歸方程計(jì)算Na3C6H5O7·2H2O的濃度。

2.2 滴定法

2.2.1 儀器和試藥

電子天平（精度0.1 mg，瑞士梅特勒公司）；無水冰醋酸（Biochem Chemopharma，色譜純，含水量≤0.05%，CAS：64-19-7）；結(jié)晶紫指示劑（C25N3H30Cl，CAS：548-62-9，稱取1 g 經(jīng)過認(rèn)證的結(jié)晶紫生物染色劑，溶于100 mL 無水冰醋酸中，即得）；高氯酸滴定液：0.01 mol/L（經(jīng)標(biāo)定的0.1 mol/L 高氯酸滴定液用無水冰醋酸稀釋10 倍，標(biāo)定即得）。

2.2.2 試驗(yàn)方法

取一支采血容器，用純凈水分別沖洗試管和試管塞3 次，倒入250 mL 的錐形瓶中。 使用干燥箱在大約95℃溫度條件下將溶液緩慢蒸干，將溫度提高到120℃保持30 min 以移除殘留水分，放入干燥器中。 待冷卻至室溫后加入約50 mL 冰醋酸溶解干燥殘留物，加入2 滴結(jié)晶紫試液并將錐形瓶置于電磁攪拌器上攪拌。用0.01 mol/L 高氯酸滴定溶液滴定，溶液變?yōu)轷r綠色即為滴定終點(diǎn)。 同法用空白試驗(yàn)校正滴定結(jié)果。 用1 mL 0.01 mol/L 高氯酸滴定溶液測定0.980 3 mg 的Na3C6H5O7·2H2O，并根據(jù)抗凝劑與血液比例及公稱容量，計(jì)算出Na3C6H5O7·2H2O 的濃度。

由于冰醋酸隨溫度升高而膨脹，體積變化較大，使用溶液時(shí)，若與標(biāo)定溫度有差別，則應(yīng)重新標(biāo)定或校正濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍試驗(yàn)

3.1.1 滲透壓法

測定每個(gè)濃度溶液的滲透壓值2 次，取其平均值作為滲透壓值，以濃度Y（%）為縱坐標(biāo)，滲透壓值X（mOsm/kg）為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程（n=5）為：Y=0.0114X-0.2231， 相關(guān)系數(shù)r=0.999 8， 結(jié)果表明：Na3C6H5O7·2H2O 濃度在2%～6%內(nèi)，滲透壓與濃度呈正比，且相關(guān)性良好。

3.1.2 滴定法

經(jīng)考察臨床使用的采血容器公稱容量一般為2～3 mL，血液體積和液體抗凝劑體積之比為9∶1 和4∶1，根據(jù)YY 0314—2007 中“附錄NC.3”中的要求：Na3C6H5O7·2H2O 含量在3.13%～3.5%，即含量為6.26～21.00 mg。用滴定法考察0.01 mol/L 高氯酸滴定溶液滴定3.5～35 mg 的Na3C6H5O7·2H2O 消耗體積。 本次試驗(yàn)分別移取濃度為0.35%的溶液1、2、4、6、8、10 mL各3 份至250 mL 錐形瓶中，按照“2.2.2 試驗(yàn)方法”滴定每個(gè)體積溶液的Na3C6H5O7·2H2O 含量，取其平均值，以滴定體積為橫坐標(biāo)，Na3C6H5O7·2H2O 含量為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程（n=6）：Y=0.9712X+0.0985，相關(guān)系數(shù)r=0.999 98，結(jié)果表明：Na3C6H5O7·2H2O 含量在3.5～35 mg 內(nèi)，0.01 mol/L 高氯酸滴定溶液消耗體積與Na3C6H5O7·2H2O 含量呈正比，且相關(guān)性良好，結(jié)果詳見表1。

表1 滴定法測定Na3C6H5O7·2H2O 含量試驗(yàn)結(jié)果

3.2 精密度試驗(yàn)

本次試驗(yàn)以公稱容量為2 mL，濃度為3.5%的血液體積和液體抗凝劑體積之比為9∶1 的采血容器作為試驗(yàn)對象，比較2 種方法的精密度，分別用滲透壓法和滴定法連續(xù)測定7 次，結(jié)果詳見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（單位：%）

由以上數(shù)據(jù)可知， 滲透壓法和滴定法測定濃度為3.50%的Na3C6H5O7·2H2O 標(biāo)準(zhǔn)溶液的試驗(yàn)結(jié)果RSD 分別為0.278%和0.306%，總體測定結(jié)果表明2種方法均有較好的精密度。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

研究顯示，目前臨床使用的采血容器多為PET（Polyethylene Terephthalate）材質(zhì)管體，橡膠塞蓋。本次試驗(yàn)以公稱容量2 mL 濃度3.5%的血液體積和液體抗凝劑體積之比為9∶1 的采血容器作為試驗(yàn)對象，添加濃度為3.5%的Na3C6H5O7·2H2O 溶液0.2 mL至采血容器中，在血液混勻器上混合過夜。分別測定每份供試品的含量，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由以上數(shù)據(jù)可知，滲透壓法和滴定法測定公稱容量為2 mL，濃度為3.5%的血液體積和液體抗凝劑體積之比為9∶1 的采血容器的試驗(yàn)結(jié)果RSD 值分別0.143%和0.294%，2 組數(shù)據(jù)RSD 值無明顯差異。

表3 Na3C6H5O7·2H2O 含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（單位：%）

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取常用的公稱容量2 mL 的血液體積和液體抗凝劑體積之比為4∶1 的氯化聚乙烯（PEC）及PET管體材料采血容器作為試驗(yàn)對象，冷藏保存。 考察其在1 年期內(nèi)檸檬酸鈉溶液濃度變化情況，結(jié)果詳見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（單位：%）

由測定結(jié)果可見，1 年期內(nèi)滲透壓法測定的濃度隨著時(shí)間的推移，PEC 材質(zhì)Na3C6H5O7·2H2O 溶液由3.24%逐漸升高到3.46%，PET 材質(zhì)Na3C6H5O7·2H2O溶液由3.22%逐漸升高到3.35%，而滴定法測定的濃度隨著時(shí)間的推移變化不大。 這是由于隨著時(shí)間的推移，采血容器的管體和管帽具有一定的透氣率和透水率，引起Na3C6H5O7·2H2O 溶液濃度的升高，同時(shí)管帽的材質(zhì)也可能會引起溶液滲透壓的變化。

3.5 回收率試驗(yàn)

以2 mL 血液體積和液體抗凝劑體積之比為4∶1的已知Na3C6H5O7·2H2O 含量的采血容器的樣品（濃度為3.24%，即12.96 mg）為基質(zhì)，分別加入不同體積的濃度為3.5%的Na3C6H5O7·2H2O 溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定3 次，結(jié)果詳見表5。

結(jié)果顯示，滲透壓法和滴定法加標(biāo)回收率分別為100.50%～102.57%和99.52%～100.86%，均符合《中國藥典》2015 年版第四部中《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》待測成分含量在1%～10%，回收率要求92%～105%的限定要求。 由此可知，2 種檢測方法均具有良好的加標(biāo)回收率，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

4 結(jié)論

從線性范圍、精密度、重復(fù)性、回收率等方面對測定進(jìn)行方法考察，可以得出2 種方法均能夠比較準(zhǔn)確地測定采血容器中Na3C6H5O7·2H2O 的含量，達(dá)到檢測目的。同時(shí)，穩(wěn)定性試驗(yàn)中的滲透壓法測定后期試驗(yàn)結(jié)果明顯大于滴定法，反映出管體和管帽的材質(zhì)對試驗(yàn)結(jié)果有較大的影響，導(dǎo)致滲透壓的結(jié)果偏高。 滲透壓法過程簡單，使用的儀器價(jià)格便宜，可操作性強(qiáng)，但受采血容器管體本身透氣透水的影響，會造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。 相對而言，滴定法較為煩瑣，但不受容器本身的影響，結(jié)果準(zhǔn)確性高，可以為臨床和檢測提供可靠結(jié)果。