施用中藥渣堆肥對土地整治區(qū)新改土土壤細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響

羅友進 廖敦秀 韓國輝 胡佳羽 張慧 余端 李燕 謝永紅

摘要：【目的】探討施用中藥渣堆肥對土地整治區(qū)新改土土壤細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響，為土地整治區(qū)新改土的培肥及中藥渣的資源化利用提供科學依據(jù)?！痉椒ā坎捎肐llumina MiSeq平臺高通量測序技術(shù)，在高粱—油菜輪作模式下，設4種中藥渣堆肥用量處理，分別為復合肥900 kg/ha（CK）、中藥渣堆肥30 t/ha+復合肥900 kg/ha（ZYZ1）、中藥渣堆肥60 t/ha（ZYZ2）和中藥渣堆肥90 t/ha（ZYZ3），高粱收獲后采集0～20 cm土層樣品，測定土壤基本理化性質(zhì)，進行土壤細菌16S rRNA測序，并分析土壤細菌多樣性、群落構(gòu)成及相對豐度，并進行土壤理化性質(zhì)與細菌群落多樣性的相關(guān)分析?！窘Y(jié)果】與CK相比，隨著中藥渣堆肥用量的增加，土壤pH和有機質(zhì)含量逐漸升高，土壤全鉀含量先降低后升高，土壤全磷和速效鉀含量先升高后降低;各中藥渣堆肥處理的土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷酸根含量均顯著低于CK（P<0.05）?；?6S rRNA的高通量測序共獲得119108個有效序列，得到7759個OTUs。施用中藥渣堆肥會改變新改土土壤細菌群落組成，增加了5～6個土壤細菌菌門數(shù)量;提高了綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度，增幅分別為7.1%～16.7%和5.4%～10.6%;降低了變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度，降幅為8.4%～21.2%。多樣性分析結(jié)果表明，隨著中藥渣堆肥用量的增加，土壤細菌多樣性表現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢。聚類分析結(jié)果表明，4個處理歸為2類，即CK和ZYZ3、ZYZ1和ZYZ2。冗余分析結(jié)果表明，土壤細菌群落主要受pH、NO3--N和有效鉀含量的影響，同時有機質(zhì)、全鉀、P3O43-和NH4+-N也對其有一定影響?！窘Y(jié)論】施用中藥渣堆肥能提升土地整治區(qū)土壤肥力，改善其細菌群落組成，但要合理控制其施用量，以施用30 t/ha中藥渣堆肥+復合肥900 kg/ha與施用60 t/ha中藥渣堆肥為佳。

關(guān)鍵詞： 新改土;土地整治區(qū);中藥渣堆肥;細菌多樣性;細菌群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S156;S154? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2394-07

Effects of herb residue compost on soil bacterial diversity and community structure of new reconstructed soil in restoration area

LUO You-jin1， LIAO Dun-xiu2， HAN Guo-hui1， HU Jia-yu1， ZHANG Hui2，

YU Duan2， LI Yan2*， XIE Yong-hong1

（1Fruit Research Institute， Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing? 401329， China; 2Institute of Environment and Resources in Agriculture， Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing? 401329， China）

Abstract：【Objective】The experiment was conducted to explore the effects of herb residue compost on soil bacterial diversity and community structure in land reconstructed area in order to provide scientific basis for the fertilization of newly reconstructed soil and utilization of herb residue compost. 【Method】The illumina platform MiSeq high-throughput sequencing technology was used to sequence facility soil bacteria 16s rRNA from four treatments [chemical fertilizer 900 kg/ha（CK），? herb residue compost 30 t/ha and chemical fertilizer 900 kg/ha（ZYZ1），? herb residue compost 60 t/ha（ZYZ2） and? herb residue compost 90 t/ha（ZYZ3）] in sorghum-rape rotation system after sorghum harvested， and the soil basic physical and chemical properties of 0-20 cm soil layer was detected by traditional chemical methods. The diversity， structure and relative abundance of soil bacteria and the correlation between soil bacteria community composition and soil basic properties was analyzed. 【Result】The results showed that the soil organic matter content and pH was increased with herb residue compost application increased compared with CK， soil total potassium content was increased first and then decreased， soil total phosphorus content and available potassium content were decreased first and then increased， and the contents of soil ammonium nitrogen， nitrate nitrogen and water-soluble phosphate were significantly decreased in herb re-sidue compost application treatments（P<0.05）. A total of 7759 operational taxonomic units（OTUs） and 119108 effective sequences were detected based on 16S rRNA high-throughput sequencing. Herb residue compost application could change soil bacterial composition， increase the number of five to six bacterial phyla. It also increased the relative abundance of Chloroflexi and Acidobacteria increased by 7.1%-16.7% and 5.4%-10.6% respectively， but that of Proteobacteria decreased by 8.4%-21.2%. Diversity analysis indicated that， soil bacterial diversity increased and then decreased with the increasing of herb residue compost application amounts. Hierarchical clustering results showed that the four treatments was clustered into two groups， CK and ZYZ3，ZYZ2 and ZYZ1. Redundancy analysis also showed that soil bacterial community was mainly affected by pH，NO3--N and available potassium，and also affected by organic matter，total potassium， P3O43- and NH4+-N. 【Conclusion】In general， the soil fertility and bacterial community of land restoration area can be? improved by application of herb residue compost， but the application amount should be? controlled. The optimal amount is herb residue compost 30 t/ha+chemical fertilizer 900 kg/ha and herb residue compost 60 t/ha.

Key words： newly reconstructed soil; land restoration area; herb residue compost; bacterial diversity; bacterial community

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0800606）; Incentive and Guidance Special Project of Chongqing Research Institutes（CSTC2018JXJl80033，CSTC2017JXJl80020）;Major Innovation Project for Agriculture Science and Technology of Chongqing Academy of Agricultural Sciences（NKY2017 AB002）

0 引言

【研究意義】土地整治以增加耕地面積，提升糧食產(chǎn)能為主要目的，是目前土地利用管理的重要手段之一（Yan et al.，2015），但其更多關(guān)注新增耕地數(shù)量，而對新增耕地質(zhì)量關(guān)注較少。土地整治工程多采用挖高填低、表土剝離及有機肥培肥等方式，在優(yōu)化生產(chǎn)和維持農(nóng)田景觀功能的同時，會對農(nóng)田生態(tài)，尤其是土壤生態(tài)（微生物群落等）造成大幅干擾（王軍等，2011）。土壤微生物在維持土壤生態(tài)功能中扮演著重要角色（Nannipieri et al.，2003），其中細菌在土壤微生物數(shù)量中占有絕對優(yōu)勢，決定著土壤微生物總量的分布，影響著有機物的分解和轉(zhuǎn)化（Zimmerman，2010）。隨著我國中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，中藥渣廢棄量越來越大，以中藥渣為原材料生產(chǎn)有機肥，合理科學利用中藥渣有機肥進行改土培肥是實現(xiàn)中藥渣資源化利用的有效方式之一（常義軍等，2010）。因此，探討施用中藥渣有機肥對土地整治區(qū)土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響，對土地整治區(qū)土壤培肥和可持續(xù)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】國內(nèi)外關(guān)于施用有機肥對土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響的研究主要集中于農(nóng)田，而對土地整治區(qū)新改土影響相對較少。白震等（2008）通過黑土肥料定位試驗研究，發(fā)現(xiàn)施用有機肥可顯著增加土壤微生物量碳/氮及真菌和細菌的磷脂脂肪酸含量，提高土壤真菌/細菌比值，且生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同于化肥處理。丁建莉等（2016）依據(jù)長期定位試驗指出，在玉米—大豆輪作條件下，有機無機肥配施能有效改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提高微生物的豐度和多樣性，并提高土壤pH，減緩土壤酸化。杜思瑤等（2017）通過分析有機和常規(guī)種植條件下土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有機種植土壤含有較多的能促進植物生長和有機質(zhì)分解的細菌。郭蕓等（2017）研究指出，有機無機肥長期配施能顯著增加土壤真菌、細菌和放線菌的生物量;短期施肥則對土壤細菌多樣性及其活性的影響相對較小。于冰等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在長期施用有機肥條件下，土壤細菌種群豐度和多樣性增加，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，能支持更大、更豐富的微生物群體。劉曉丹等（2019）研究表明，有機物料部分替代化肥氮可提高麥田土壤的微生物量和微生物活性，優(yōu)化微生物區(qū)系組成。潘義宏等（2019）研究表明，氨基酸菜籽餅肥和甲殼素氨基酸有機肥與無機肥按不同比例配施均能在一定程度上提高土壤微生物數(shù)量和土壤綜合肥力。目前，在土地整治區(qū)土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究方面，林耀奔等（2019）通過對比分析土地整治區(qū)內(nèi)外土壤微生物多樣性與種群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)土地整治區(qū)內(nèi)土壤細菌的多樣性顯著提高，有機肥施用顯著提高了微生物多樣性及鞘脂單胞菌和地桿菌等土壤有益菌的豐度;施昊坤等（2020）研究了土地整治對工業(yè)區(qū)周邊土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，土地整治降低了變形菌門的相對豐度，提高了綠彎菌門和酸桿菌門及鞘脂單胞菌和地桿菌的相對豐度，土壤微生物多樣性和功能性明顯得到改善?！颈狙芯壳腥朦c】紫色丘陵土地整治區(qū)新改土土壤養(yǎng)分含量低，微生物群落組成簡單，結(jié)構(gòu)性、保水保墑能力、通氣性和肥力供應能力差。增施有機肥是解決紫色丘陵土地整治區(qū)土壤培肥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前關(guān)于中藥渣堆肥在紫色土地整治區(qū)新改土培肥中的研究較少，尤其是對其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以紫色丘陵土地整治區(qū)新改土為研究對象，采用Illumina MiSeq平臺高通量測序技術(shù)，研究中藥渣堆肥用量對新改土土壤細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為土地整治區(qū)新改土的培肥及中藥渣的資源化利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

試驗地位于重慶市農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高科技園區(qū)，年均氣溫18.3 ℃，年均日照時數(shù)1000～1400 h，年均降水量1135.6 mm。該園區(qū)于2016年完成土地整治工程，試驗前土壤pH 6.60，有機質(zhì)9.33 g/kg，全磷0.046 g/kg，全鉀22.04 g/kg，硝態(tài)氮28.5 mg/kg，銨態(tài)氮16.8 mg/kg。

1. 2 試驗方法

試驗始于2016年，采用高粱—油菜輪作種植模式，高粱品種為國窖紅1號，油菜品種為中雙11號。試驗共設4個處理，采用大區(qū)試驗，每個大區(qū)面積為20 m×30 m，各處理肥料施用情況詳見表1。其中復合肥為九禾復合肥（喜悅大地），N-P2O5-K2O含量為26-10-16;中藥渣堆肥由重慶土原生物科技有限公司生產(chǎn)，pH 7.01，有機質(zhì)含量58.5%，總養(yǎng)分為5.76%。中藥渣堆肥在高粱移栽前施入，利用深松機和旋耕機將其充分混入土壤中并耙平;復合肥于油菜/高粱定植前一次性施入，油菜和高粱栽植密度為60000～75000株/ha，試驗各處理栽培管理措施保持一致。

1. 3 土壤樣品采集

2017年9月高粱收獲后，在各處理試驗大區(qū)的對角線上采集0～20 cm土壤耕層混合樣3個，每個土壤耕層混合樣按照“W”形采樣法采集5個點，充分混勻作為1個耕層土壤樣品，將每個土樣分為2份，一份約1 kg用于土壤理化性質(zhì)測定，-4 ℃保存;另一份約100 g用于土壤細菌群落分析，-80 ℃保存。

1. 4 測定指標及方法

土壤pH使用pH計測定（土水比1∶5）;有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀滴定法測定;全磷含量采用鉬銻抗比色法測定;全鉀和速效鉀含量采用火焰光度法測定;銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷酸鹽含量采用連續(xù)流動分析儀（SKALAR SAN++）測定（魯如坤，2000）。

土壤細菌群落分析由上海派森諾生物科技股份有限公司（上海）完成，采用Illumina MiSeq平臺對細菌群落DNA片段進行雙端（Paired-end）測序。

1. 5 統(tǒng)計分析

采用QIIME進行土壤細菌群落相關(guān)指標分析;采用SPSS 20.0對土壤基本屬性進行顯著性分析;采用Canoco 5.0對土壤菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子進行主成分分析和冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同中藥渣堆肥用量對新改土土壤理化性質(zhì)的影響

由表2可知，與CK相比，隨著中藥渣堆肥用量的增加，土壤pH和有機質(zhì)含量逐漸升高;土壤全鉀含量先降低后升高，但各中藥渣堆肥處理與CK無顯著差異（P>0.05，下同）;土壤全磷和速效鉀含量先升高后降低，均以ZYZ1處理最高，與CK差異顯著（P<0.05，下同）;土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷酸根含量均以CK最高，且顯著高于各中藥渣堆肥處理。

2. 2 土壤測序結(jié)果分析

基于16S rRNA的高通量測序共獲得119108個有效序列，基于相似度97%進行聚類分析，得到7759個OTUs（圖1和表3）。從圖1可知，不同中藥渣堆肥用量處理土壤細菌的稀疏曲線趨于平緩，意味著土壤細菌測序列庫容可較好地反映細菌的種類和數(shù)量，基本涵蓋了土壤所有細菌種群。

2. 3 土壤細菌α多樣性分析

根據(jù)細菌OTUs數(shù)量計算出各處理的土壤細菌α多樣性指數(shù)（相似度為97%）。從表3可看出，土壤細菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)以ZYZ2處理最高，其次是ZYZ3和ZYZ1處理，CK最低;土壤細菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)以ZYZ3處理最高，其次是ZYZ1處理和CK，ZYZ2處理最低，且不同處理間的差異均達顯著水平。說明隨著中藥渣堆肥施用量的增加，土壤細菌多樣性表現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢，豐富度表現(xiàn)出升高—降低—升高的波動變化趨勢。

2. 4 土壤細菌群落組成分析

由圖2可看出，土壤細菌群落主要由變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等38個菌門組成。其中變形菌門占21.82%～43.05%，放線菌門占10.64%～34.14%，綠彎菌門占8.57%～25.13%，芽單胞菌門占6.16%～17.43%，酸桿菌門占4.14%～14.81%，這5個菌門在樣本群落結(jié)構(gòu)中占主導地位，分別占CK、ZYZ1、ZYZ2和ZYZ3處理樣本總量的87.45%、89.64%、92.81%和90.30%。與CK相比，施用中藥渣堆肥處理提高了綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度，增幅分別為7.1%～16.7%和5.4%～10.6%;降低了變形菌門的相對豐度，降幅為8.4%～21.2%。與CK相比，ZYZ1、ZYZ2和ZYZ3處理含有的土壤細菌菌門數(shù)分別增加了6、5和5個，即表明施用中藥渣堆肥會改變新改土土壤細菌群落組成。中藥渣堆肥處理中含有Latescibacteria、GAL15、Aminicenantes和Tectomicrobia等4個特有菌門。同時，將各處理的細菌群落進行聚類分析，結(jié)果（圖2）顯示，CK和ZYZ3與ZYZ1和ZYZ2歸為2類，表明在施用中藥渣堆肥對新改土進行改良時要注意用量，中藥渣堆肥用量過大會導致土壤細菌群落菌門數(shù)減少，同時相對豐度也會趨于簡單。

2. 5 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)分析

通過對土壤細菌群落多樣性指標與土壤基本理化性質(zhì)進行冗余分析，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，在門的水平上，軸1和軸2分別解釋了變量的78.09%和13.01%。分析4個處理間的歐幾里德距離，施用中藥渣堆肥處理與CK的土壤群落結(jié)構(gòu)差異明顯，但隨著中藥渣堆肥用量的增加，這種差異有減弱趨勢。AK、pH與NO3--N對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大。其中AK與Planctomycetes呈正相關(guān)，與芽單胞菌門呈負相關(guān);pH與綠彎菌門呈正相關(guān);NO3--N與Saccharibacteria呈正相關(guān)，與酸桿菌門和綠彎菌門呈負相關(guān)。SOM對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大，Ignavibacteriae與其呈正相關(guān)，芽單胞菌門與其呈負相關(guān)。另外，TK、NH4+-N和P3O43-對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)也有一定影響。

3 討論

3. 1 施用中藥渣堆肥對整治區(qū)新改土細菌數(shù)量的影響

土壤細菌在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)及維持土壤生物群落穩(wěn)定性與生態(tài)系統(tǒng)抗干擾能力中起重要作用（Doran and Zeiss，2000;Girvan et al.，2005）。土壤細菌數(shù)量增多和群落結(jié)構(gòu)組成多元化有利于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)恢復及生物肥力提升。王秋君等（2009）研究表明，施入菜粕堆肥、豬糞堆肥和中藥渣堆肥等外源有機物能改變土壤微生物細菌群落結(jié)構(gòu)，施入化肥則對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)影響較小。李倩等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，化肥配施牛糞或羊糞有利于提高土壤微生物生物量，同時認為這是由土壤有機碳含量、腐殖質(zhì)形態(tài)變化所引起。本研究結(jié)果表明，施用中藥渣堆肥處理土壤中細菌OTUs增加，以ZYZ3處理增加最多，表明施用中藥渣堆肥有助于提升土地整治區(qū)新改土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的恢復，其原因可能是施用中藥渣堆肥提升了土壤pH，增加了土壤中有機質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷酸根含量。

3. 2 施用中藥渣堆肥對整治區(qū)新改土細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

在評價土壤細菌群落多樣性時主要采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)及ACE指數(shù)等多樣性指數(shù)，多樣性指數(shù)越高即意味著土壤細菌群落豐富度和多樣性越高。關(guān)于施用有機肥對土壤細菌群落多樣性的影響，不同學者的研究結(jié)果存在一定差異。蘇婷婷等（2016）研究指出，配施生物有機肥和磷肥可改善新整理黃壤煙田的土壤細菌群落結(jié)構(gòu);而楊亞東等（2018）則認為，施用有機肥和化肥的小麥土壤細菌多樣性指標均不存在顯著差異。本研究結(jié)果表明，與施用化肥相比，施用中藥渣堆肥土壤細菌群落多樣性呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。這種差異可能與土壤性質(zhì)、作物種類、施用量等有關(guān)，但也表明在施用中藥渣堆肥進行土壤培肥改良時要控制其施用量。

本研究利用Illumina MiSeq平臺對施用中藥渣堆肥后新改土的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)進行研究，得到38個門水平的類群，從細菌群落門水平組成來看，變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和酸桿菌門這5個菌門在細菌群落結(jié)構(gòu)中占主導地位，占85%以上，與Liu等（2014）、孫瑞波等（2015）、楊亞東等（2018）在不同類型農(nóng)田土壤中得到的細菌優(yōu)勢類群相似。不同研究中各優(yōu)勢類群的相對豐度差異明顯，侯建偉等（2018）研究指出，農(nóng)田土壤細菌優(yōu)勢類群受到土壤類型或質(zhì)地和種植作物等的影響;楊亞東等（2018）的研究則表明土壤中放線菌的相對豐度與土壤含水量和pH存在顯著負相關(guān)。在本研究中，當施入中藥渣堆肥為60 t/ha時，土壤放線菌相對豐度較其他處理高，土壤pH也較其他處理高，其具體原因尚需進一步研究。

施用中藥渣堆肥有助于整治區(qū)新改土土壤細菌群落組成和結(jié)構(gòu)的改善，但本研究僅分析了土壤細菌群落的整體變化，并未對中藥渣堆肥特殊成分及特殊功能類群的微生物進行研究。特殊功能類群微生物參與不同的土壤代謝途徑，中藥渣堆肥的施用會引起土壤細菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化，是否會導致土壤健康狀況和生態(tài)系統(tǒng)功能變化均有待進一步研究。

4 結(jié)論

施用中藥渣堆肥有助于改善土地整治區(qū)新改土的土壤肥力，可提升土壤細菌多樣性和豐富度，但需合理控制施用量，以施用30 t/ha中藥渣有機肥+復合肥900 kg/ha與施用60 t/ha中藥渣堆肥為佳。

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（責任編輯 王 暉）